艾滋病实验室管理及安全操作7

艾滋病实验室

质量管理

实验室质量管理包括：质量保证(Qualityassurance,QA）,质量控制（QualityControl,QC）质量评价(ExternalQualityAssessment,EQA)。

一．质量保证（QA）

（一）定义质量保证是指从接收检验标本起，到实验室发出报告止，为确保实验室最终报告结果的正确性所进行的全过程，包括采取各种行政和技术上的措施和方法。

质量保证(Cont.)管理是关键(组织结构、岗位责任)硬件要规范（试剂、仪器、实验室环境）人员要合格(人员素质与培训)操作按文件（制度、操作指导、质量控制及质量记录）（二）实验室质量保证

1．行政支持

HIV初筛和确认实验室的质量保证是整个艾滋病检测工作的组成部分。要实施全面质量保证，除了各级卫生行政部门加强监督，责成专门机构负责日常管理工作外，应要求实验室所在单位加强自身管理，保证实验室主要负责人和检测人员相对稳定，并给予人力和物力的支持。

2．实验室规范化建设HIV初筛实验室和确认实验室的设置及其建筑、设施、设备必须符合《规范》要求。3．人员培训及其评价实验室人员必须接受过国家或省级HIV抗体确认中心举办的HIV抗体检测学习班培训并获得合格证书才能上岗操作。各级试验人员应该从不同渠道不断提高自己的检验水平。实验室主管人员必须具有较高的质量意识，领导整个实验室工作人员参与质量管理工作。4．标本的采集、运送和处理

运送的样品应为血清或血浆，一般不运送全血。用带螺盖的试管或严密封口，试管上应标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。随样品应附有送检单，送检单应与标本分开。如果路程较远或气候炎热，应在2-8℃条件下运送。用于抗体检测的样品可在短期内（≤48小时）室温递送。

5．检验方法和试剂的选择HIV实验室检测工作应使用最可靠的测定方法；在我国防疫系统，临床检测以及采供血系统中使用的HIV检测试剂（国产和进口）均必须是经过国家药品监督管理局批准和中国药品检定所批批检合格的诊断试剂盒。各HIV检测实验室在使用试剂时，应优先选择经过临床评估质量优良的试剂盒。

6．设备维护与校准实验室中的设备必须定期进行维护与校准，并制定设备维护与校准制度。（1）ELISA洗板机与酶标仪是检测HIV的最常用和最重要的仪器，应该设立预防性的维护制度，以保证仪器的正常工作。（2）移液器（包括单头和多头移液器）是实验室中重要的基本器具，一年至少应该标定一次，若发现移液器有异常情况，应该随时进行校准。（3）每天检查室内普通冰箱和孵育箱的温度并作好记录。（4）定期检查其他相关的仪器设备

7．文件和文件管理

(1)建立标准操作程序文件(SOP)SOP是书面质量体系中的一个很重要的部分。SOP是指导完成检测工作的一整套书面操作指南。因此，每个实验室应就本实验室所有重要工作制定相应的SOP。

HIV检测实验室文件和文件管理要求（1）建立标准操作程序文件(SOP)（2）建立实验原始记录表

（3）建立HIV抗体检测程序（4）填写检测结果表（5）建立标本的登记记录

实验室收到标本后，有关参数应该及时登记在标本的登记记录中，包括受检者的姓名或代号、试管编号、性别、年龄、职业、送检单位、人群类别、检验结果(包括初筛、复检、确证)、送检日期、报告日期、备注(必要时记录通信地址)。HIV检测实验室文件和文件管理要求（6）建立HIV阳性标本的保存记录记录中填写阳性标本血清/血浆的储存量、标本储存温度、标本储存起始时间以及标本保管人姓名。所有经确认的阳性标本，包括实验室留存的标本，应送省级HIV抗体确认中心或省级卫生行政部门指定的单位保存，不得擅自处理。（7）建立实验室安全措施参见《规范》HIV检测实验室文件和文件管理要求（8）文件存档原始记录包括实验原始记录表、打印数据、膜反应条带或其照片、检测记录表、标本登记记录、标本保存记录以及仪器设备维修和校准记录等重要记录都应该妥善存档保存15年以上。推荐同时使用计算机保存各种文件和记录。内含病人姓名的所有工作记录一定要保密，参见《规范》。

艾滋病实验室应建立以下SOP样品的接收、登记和处理，检测方法和步骤，仪器的使用维护和校准，实验中的质量控制，结果解释与报告，保密程序，检测数据的记录与保存，追踪和处理，实验室的清理和消毒，实验室安全防护。SOP的总结

写所做的做所写的记录所做的改不完善的文件和文件管理原则

（一）操作规程和操作手册每个实验都应有操作规程或操作手册，要准确、规范，妥善保管，每个检验人员都能随时查阅。(二)原始记录1、记录是为已完成的活动或得到的结果提供客观证据的文件。2、记录有一定格式，相应的表格经过实践和评审使之完善。3、实验室工作人员不但应注重试验，而且应重视记录。＊记录实验室温度、湿度、试剂厂家名称批号和效期等。＊详细的记录是分析、统计、总结的基础。(二)原始记录4、资料的可追查性＊当报警信号发出后，可以追查原始资料和原始操作记录。＊完整资料将为科研和法律诉讼提供可靠的证据。5、更改数据或文字 ＊按规则进行（如双杠改，签字）（三）文件存档1.文件和试验记录存档，一般应为3年～5年期限。艾滋病实验室要按“规范”要求（15年）。2.存档的资料不应随便堆放，应按一定方式编号，便于查询。查询不到的存档资料等于没有存档。3.资料的存档制度、查询制度、借阅制度、保密制度应健全。（三）文件存档4.资料是实验室的公有财产，即使是一个人做的实验，做的记录，也不可以任意将资料带走、借走、丢失、不归还或更改。5.实验室应有人专职或兼职任资料保管员，以便查询。查不到的资料等于没有做记录，也等于没有做前面的一切有关工作，因此，检验人员必须重视记录和存档工作。二．质量控制(QC)

(一)定义质量控制是指为确保实验工作正常进行而在每一次实验过程中必须采取的各种措施。

(二)质量控制血清

一般使用内部对照质控血清和外部对照质控血清来进行质量控制。

1．内部对照质控血清内部对照质控血清是指每个试剂盒内由试剂厂家提供的一套阴性和阳性对照血清。内部对照是质量控制的基础。每一次检测必须使用内部对照，而且只能在该批号生产的试剂盒中使用。2．外部对照质控血清外部对照质控血清是各级实验室为了监控每次检测的重复性和稳定性以及检验试剂盒批间差异而设置的一套阴性和阳性对照血清。设立外部对照还可以提示标本处于临界值状态时的检验操作情况。

(1)外部对照质控血清的组成外部对照应该包括强阳性对照、弱阳性对照和阴性对照。也可在每次实验时设置一个单一浓度水平的质控品即弱阳性对照。这个弱阳性对照的值以设定在该试剂盒Cut-off值的2-3倍为宜。(2)外部对照质控血清的制备

HIV抗体阳性或阴性人血清，56℃30分钟加热灭活，3000转／分钟离心15分钟；

弱阳性对照：可以通过使用HIV抗体阴性的正常人血清梯度稀释HIV抗体强阳性血清并经标定后得到。56℃30分钟加热灭活后，加入不影响检测结果的防腐剂（或用0.2μm生物滤膜过滤除菌）。弱阳性对照的OD值以2-3倍于Cut-off为宜(3)外部对照质控血清的保存1)外部对照血清标定后应该等量分装，每个分装的量应足够一周使用2)外部对照血清应该存放-20℃以下冰箱3)外部对照血清一旦融解以后应该存放在2-8℃，一周后必须弃去，不能重新冻存。(4)外部对照质控血清的使用原则上每一次实验必须使用外部对照质控血清，建立质控图，以便监控实验操作的一致性和结果的准确性。同时可以了解各批试剂盒之间的误差(批间差异)（三）质控图建立1建立质控图参数一般采用在不同批次检测取得至少20个数据；如果仅做少量批次的检测，也至少做5个批次的检测，每个批次中不少于4个质控物测定结果，以建立一个临时性的平均值和标准差，当达到20批次数据后，替代临时性的平均值和标准差。1建立质控图参数①算术平均值(X)，代表一组OD值数的平均值。为了统计学上有显著性意义，应该采用至少20次(天)所测得的外部对照质控血清OD值结果计算出平均值。②标准差(S)，是描述样本与均数之间离散程度的一个指标，是与对照值的均值有关的预期范围。一组OD值标准差以S表示。③变异系数(CV)，是反映各次0D值相对于均值的离散程度的一个指标，可以用于衡量被检标本检测的重复性或精密度。④控制限：外部对照S/CO值的±2s和±3s。实验室在报告实验结果之前必须评价质控数据。目前许多质控规则已被采用，常用的是12S和13S规则。X计算公式为S计算公式为：

CV计算公式为：2建立质量控制图和质量控制图的分析，见范例附图①质控图的定义把检验性能数据与计算出的“控制线”进行比较的图。②质控图的构成质控图有一中心横线及其上、下各一或两条平行的控制线，并有按时间顺序填入的各质控血清测定的数值。③质量图的制作方法质控图制作的关键是对控制限的选择，一般是依照正态分布2S或3S来确定。a．在常规条件下，对同一批血清连续测定20次或20次以上，获得一组数据，求均数(X)和标准差(S)，参见上述计算公式，20个数据中超出2S或3S的数据不应删除。b．将均值(X)和标准差(S)分别在质控框架图中标示出来。每个质控对照的密光度值／Cut-off比值(S／CO，S为样品OD值；CO为Cut-off值)作纵座标(Y轴)，每一次(天)实验作横座标(X轴)，建立质控图。c.从第21次起，每次检测的质控血清的结果依次点入该质控框架图中，检验进入质控状态。见范例(范例为20次检测)。次数质控血清ODCut-off值ODS/CD值10.1800.1051.7120.1900.1051.8130.2000.1051.9040.2280.1051.8150.1370.1051.0960.2210.1052.1070.1500.1051.4380.1700.1051.6290.1800.1052.14100.1500.1051.43次数质控血清ODCut-off值ODS/CD值110.2000.1051.90120.1420.1051.35130.2100.1052.00140.2210.1051.52150.1800.1051.71160.1900.1051.81170.1600.1051.52180.2210.1052.10190.2100.1052.00200.1500.1051.43范例参考郑怀竞主编《免疫学检验室间质评与室内质控》，1997年出版。通过上表，计算S／C0值的均值(X)，标准差(S)和变异系数(CV)X＝1．72S＝0．29CV=16．9％根据以上数据绘制室内质控框架图

(Levey-Jennings控制图)3S2SSX-S-2S-3S

利用质控图可以对每次检验的结果进行监测，举例见下表，并将表中每次检验S／CO值点入质控图中次数日期质控血清ODCut-off值S/CO值217.40.1600.1051.52227.70.1900.1051.81237.80.2000.1051.90247.110.2280.1051.81257.120.1390.1051.10267.150.2210.1052.10277.160.1500.1051.43287.180.1700.1051.62297.190.2250.1052.14

（四）质控规则及使用常使用的是12S和13S规则a告警（12S）：当外部对照的S/CO值超出+2s范围时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。若将12S做失控标准，有较高的假失控概率，所以一般不采用。b失控（13S）：当外部对照的S/CO值超出+3s范围时，系统处于失控状态，本次实验结果不能被接受，可能是系统误差、随机误差或外部对照滴度下降造成。

c位移：连续几次（3

5次）外部对照S/CO值都落在均值的一侧则称为位移，提示实验条件发生了较大的变化。d趋势：连续几次（5

7次）外部对照S/CO值几乎按一个方向分布时称为趋势，通常由参数的缓慢改变引起。

考察试验系统的可靠性可采用多标准质控方案，其要点为出现一次2s范围的变化时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。出现下列情况时，应暂停检测查找原因：出现一次3s范围的变化、连续两次出现同一方向2s范围的变化、连续四次出现同一方向的1s范围的变化、连续10次结果都在1s范围内，但落在均值线的同一侧。⑤绘制和分析质控图的要点：a.要在最佳条件下建立质控图参数；b.用S/CO比值绘制质控图c.由专人负责建立质控图，每月定期召开质量分析会；讨论本月的质量控制情况。每次检测之前都应了解质控结果。

d.建议长期和稳定地使用一种质量好的试剂盒e.更换不同厂家的试剂盒后，必须重新绘制质控图。改用新批号试剂盒如结果偏离较大也应重新制作质控图。使用新批号或不同厂家的试剂盒必须在质控图上注明使用日期。f.发现质控结果失控,应填写报告单，上交质量负责人，分析原因并决定是否发出检测报告。g.使用新批次的外部对照质控血清时，必须重新绘制质控图。

3)CV分析

变异系数(CV)在＜20％区间，表示对照值处于稳定状态。

（五）实验室质量控制可分为：内部质量控制和外部质量控制前面叙述的内容属内部质量控制

外部质量控制包括：外部制度，管理监督外部实验室质控样品检测内部质量控制：内部管理制度：环境，仪器，试剂，耗材内部监督检查：质量监督员，质量活动标准操作程序：质量保障计划：内部对照质控检测结果质控样品控制试剂控制设备控制过程控制环境条件控制检测数据和结果报告质控

检测报告--管理内容：样品接受：唯一编号，接收程序，文件管理，合同评审检测报告编号、签字、盖章、发放、存档程序设备管理：采购，计划，检定试剂耗材采购，质控程序，不满意/抱怨处理程序，报告质控安全防护：保护措施，有问题如何处理，药物保管人，使用要求环境要求：检测报告--技术内容：样本：要求，制备，保存方法：依据，原理，适用范围，有效性，SOP，质控试剂/耗材：名称，批号，效期，使用要求，适用范围，保存条件要求，产品质量服务评价，验收设备：原理，适用范围，检定效期，保管人，使用记录，状态，维修，归档记录：格式，要求，意义标准品：来源，品质，效期，要求，适用范围结果质控：内部质控，外部质控检测报告检测者职责审核者职责签发者职责HIV实验室检测项目质控1、抗体检测（1）EIA检测（2）快速检测（3）WB检测2、抗原检测3、病毒载量检测4、CD4/CD8检测5、实验室考核与试剂评估质控EIA检测质控环境人员培训与检测技术样品质控品酶标仪洗板机加样器离心机试剂与耗材（tip头等）实验过程，记录快速检测质控 环境 人员培训检测技术 样品 试剂 实验过程，记录WB检测质控环境人员培训检测技术：过夜，不过夜样品质控品摇床或全自动蛋白印迹仪加样器离心机试剂与耗材实验过程，记录三．室间质量评价(EQA)

(一)定义质量评价是一种手段，用于判定实验室测定结果的质量。通常使用有关权威机构提供的一套质控品(质量控制参比血清)从外部来评价实验室的工作，即对数个实验室的检测结果进行统计分析和评价。这种评价方式常称为室间质量评价(即EQA)。

室间质评与室内质控的关系（一）室内质控是对检验结果的即时性评价，通过对室内质控结果的连续观察，监测实验室检验结果的精密性。室内质控是基础，没有完善的室内质控措施就谈不上质量保证，即使在室间质评中取得很好的成绩也不能说明实验室检验结果的可靠性。因此，实验室的质量保证工作，应首先从室内质控做起，持之以恒，不断的观察、分析和解决实验中的质量问题，才能使检验工作的质量得到稳步提高。室间质评与室内质控的关系（二）室间质评是对检验结果的回顾性评价，其主要目的是评价和修正实验室检验结果的准确性，并与各参评单位结果比较，了解本室结果的偏倚程度，是发现实验室系统误差的重要手段之一。室间质评应在室内质控具有相当水平的基础上进行，因为实验室没有稳定可靠的室内质控措施，就不可能获得良好的精密性，没有良好的精密性是谈不上准确性的。因此，实验室不能好高鹜远，舍本求末,只重视室间质评的成绩，而不实实在在地抓好室内质控。当然，室内质控和室间质评都是质量保证的重要环节之一，两者应互为补充，辩证统一，缺一不可。评价体系艾滋病参比实验室和一些艾滋病确证中心实验室参加相关国际机构的室间质量评价活动。艾滋病参比实验室对全国艾滋病确认中心实验室和艾滋病确认实验室进行室间质量评价，并负责提供室间质量评价标本、评价标准以及有关文件。

艾滋病确证中心实验室对本省的艾滋病筛查实验室进行室间质量评价。艾滋病初筛中心实验室对辖区内艾滋病筛查实验室进行室间质量评价。质量评价用于评价质量保证体系的效果，其目的在于帮助发现其质控与质保系统有无问题。各实验室可根据上一级提供的质评检验报告的结果，检查其质量控制状况。实验室设备管理实验室设备管理

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4管理要求4.1组织4.2管理体系4.3文件控制4.4要求、标书和合同的评审4.5检测和校准的分包4.6服务和供应品的采购4.7服务客户4.8投诉4.9不符合检测和/或校准工作的控制4.10改进4.11纠正措施4.12预防措施4.13记录的控制4.14内部审核4.15管理评审5技术要求5.1总则5.2人员5.3设施和环境条件5.4检测和校准方法及方法的确认5.5设备5.6测量溯源性5.7抽样5.8检测和校准物品的处置5.9检测和校准结果质量的保证5.10结果报告《检测和校准实验室能力认可准则》有关设备的条款5.5设备5.5.1实验室应配备正确进行检测和/或校准（包括抽样、物品制备、数据处理与分析）所要求的所有抽样、测量和检测设备。当实验室需要使用永久控制之外的设备时，应确保满足本准则的要求。5.5.2用于检测、校准和抽样的设备及其软件应达到要求的准确度，并符合检测和/或校准相应的规范要求。对结果有重要影响的仪器的关键量或值，应制定校准计划。设备（包括用于抽样的设备）在投入服务前应进行校准或核查，以证实其能够满足实验室的规范要求和相应的标准规范。设备在使用前应进行核查和/或校准（见5.6）。5.5.3设备应由经过授权的人员操作。设备使用和维护的最新版说明书（包括设备制造商提供的有关手册）应便于合适的实验室有关人员取用。5.5.4用于检测和校准并对结果有影响的每一设备及其软件，如可能，均应加以唯一性标识。5.5.5应保存对检测和/或校准具有重要影响的每一设备及其软件的记录。该记录至少应包括：a)设备及其软件的识别；b)制造商名称、型式标识、系列号或其他唯一性标识；c)对设备是否符合规范的核查(见5.5.2)d）当前的位置（如果适用）；e）制造商的说明书（如果有），或指明其地点；f)所有校准报告和证书的日期、结果及复印件，设备调整、验收准则和下次校准的预定日期；g)设备维护计划，以及已进行的维护（适当时）；设备的任何损坏、故障、改装或修理。

5.5.6实验室应具有安全处置、运输、存放、使用和有计划维护测量设备的程序，以确保其功能正常并防止污染或性能退化。注：在实验室固定场所外使用测量设备进行检测、校准或抽样时，可能需要附加的程序5.5.7曾经过载或处置不当、给出可疑结果，或已显示出缺陷、超出规定限度的设备，均应停止使用。这些设备应予隔离以防误用，或加贴标签、标记以清晰表明该设备已停用，直至修复并通过校准或检测表明能正常工作为止。实验室应核查这些缺陷或偏离规定极限对先前的检测和/或校准的影响，并执行“不符合工作控制”程序（见4.9）。5.5.8实验室控制下的需校准的所有设备，只要可行，应使用标签、编码或其他标识表明其校准状态，包括上次校准的日期、再校准或失效日期。5.5.9无论什么原因，若设备脱离了实验室的直接控制，实验室应确保该设备返回后，在使用前对