基因工程-绪论

基因工程GeneEngineering细胞工程教研室张光谋gmzhang@3029114(办论

在生物进化过程中，遗传和变异是两个重要的概念。

遗传性赋予生物种的稳定。

变异性赋予生物种的进化。极端嗜热菌：能生长在90℃以上的高温环境，是生物界耐受高温的冠军。极端嗜盐菌：生活在高盐度环境中，盐度可达25%，如死海和盐湖中，它们通过其细胞膜上光驱动的质子泵，产生质子动力势，合成ATP。极端嗜酸菌：能生活在pH值1以下的环境中，往往也是嗜高温菌，生活在火山地区的酸性热水中，能氧化硫，硫酸作为代谢产物排出体外。极端嗜碱菌：多数生活在盐碱湖或碱湖、碱池中，生活环境pH值可达11.5以上，最适pH值8-10。自然发生的变异是非常缓慢的。随着生物技术的发展，人们开始学会干预生物的变异。20世纪70年代，基因工程学诞生：以重组DNA技术，短时间内改造生物的遗传特性。一、基因工程的诞生

1973年

现代分子生物学：

理论上的三大发现技术上的三大发明

1、理论上的三大发现

40年代，发现生物的遗传物质是DNA。

——明确了遗传的物质基础问题

50年代，揭示了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。

——解决了基因的自我复制和传递的问题60年代，相继提出“中心法则”和“操纵子学说”，成功破译遗传密码。

——

阐明了遗传信息的流向和表达问题科学发展历程1953NewDiscovery2、技术上的三大发明

限制性核酸内切酶的发现

基因工程的可能性：理论上

困难：庞大的dsDNA，不能获得单个的基因片段。1970年美国约翰·霍布金斯大学H.Smith偶然发现:流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA，无细胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解自身DNA，即HindII酶

1972年Boyer实验室EcoRI5’…GAATTC…3’3’…CTTAAG…5’

DNA连接酶的发现

1967年，世界上有5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。

DNA连接酶能够参与DNA缺口的修复。

1970年，美国Khorana实验室，发现

T4DNA连接酶，具有更高的连接活性。

基因工程载体的发现

有了对DNA

切割与连接的工具酶，还不能完成

DNA体外重组的工作

大多数DNA片段不具备自我复制的能力，必须将DNA片段连接到一种特定的、具有自我复制能力的DNA分子上。

——载体（Vector）？

载体的研究先于限制性核酸内切酶。

1946年，Lederberg

开始研究细菌的性因子——F因子

50和60年代，相继发现其它质粒，抗药性因子（R因子）大肠杆菌素因子（CoE因子）

1973年，Cohen

将质粒作为基因工程的载体使用。

1972年，美国斯坦福大学

P.Berg研究小组

使用限制性内切酶EcoRI，在体外对猿猴病毒SV40和λDNA分别进行酶切，然后再用T4DNA连接酶连接，获得了杂种DNA分子。——第一次成功实现DNA体外重组

1973年，美国斯坦福大学S.cohen等人，也成功的进行了另一个体外重组实验并实现了细菌间性状的转移。——基因工程发展史上第一次实现重组体转化成功的例子。（一）定义：

大多数西方国家对此都有一个精确的法律定义，（由于政府对之的法律约束），一般说来，将基因工程定义为：将在细胞外产生的核酸分子插入病毒,质粒或其它载体系统中，再整合到那些本来不含该类物质的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。二、基因工程的定义及主要研究内容强调

外源核酸分子(一般为DNA)在不同宿主中的繁殖；打破自然种的界限；将来自不相关物种的基因放入一个宿主中。通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新的生物类型。定义：相关的名称：

遗传工程（Geneticengineering)

基因操作（Genemanipulation)

重组DNA技术（RecombinantDNAtechnique)

分子克隆（Molecularcloning)

基因克隆（Genecloning)

遗传工程比基因工程有更广泛的内容，凡是人工改造生物遗传性的技术如物理化学诱变、细胞融合、花粉培育、常规育种、有性杂交等，还包括基因工程在内。遗传工程包括基因工程。遗传工程不等于基因工程。

重组DNA技术

基因工程的核心内容。严格地说，基因工程除上述定义所阐明的内容外，还包括体外DNA突变、体内基因操作以及基因的化学合成等。

重组DNA技术不等于基因工程。

克隆（Clone）

当作名词使用时，是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。当作动词使用时，则是指从同一祖先产生这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程。因此，基因工程也可称为基因克隆或DNA分子克隆。

（三）基因工程的研究步骤1.从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。2.在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞，并与之一起繁殖。4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞类型。5.从这些筛选出的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步研究使用。6.将目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞，使之在新的遗传背景下，产生出人类所需要的物质。基因工程技术路线基因工程技术路线1、DNA片段的取得（目的基因的分离和制备）2、DNA片段和载体的连接——重组体DNA3、外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基因文库4、选择基因（目的基因）5、目的基因表达切接转选表达基因工程技术路线（四）基因工程的理论依据1.不同基因具有相同的物质基础基因是遗传信息的基本单位从物质结构上看，基因是核酸分子

基因是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段，可以是连续的，也可以是不连续的，可以是DNA也可以是RNA，可以存在于染色体上，也可存在于染色体之外（如质粒、噬菌体等）

2.基因及其产物的共线性基因决定蛋白质的序列组成共线性：一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列一一对应例如：由N个氨基酸组成的蛋白质，其对应的基因编码区由3N个碱基组成。

在原核生物中，基因及其产物是共线性的。3.基因及其产物的非共线性

70年代，在真核生物中发现间断基因（interruptedgene）间断基因在真核生物中普遍存在，基因间存在着内含子（intron

）内含子指真核生物基因中不能翻译成蛋白质的DNA片段，但可被转录；当两侧序列（外显子）的转录RNA被剪接在一起时，就将内含子转录的RNA从整个转录产物中除去。外显子（exon）是指能够翻译成蛋白质的任一间断的基因片段，一个基因可有多个外显子。内含子并不是一成不变的，具有相对性。对一个DNA片段来说，在某个基因中是内含子，但在另一个基因中却可作为外显子。4.基因是可以切割的；5.基因是可以转移的；6.遗传密码是通用的；7.基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。（二）基因工程的研究内容基因工程克隆载体的研究原核表达载体,克隆载体;动物病毒载体;高等动植物转基因的表达载体和定位整合载体基因工程受体系统的研究原核生物:大肠杆菌,蓝藻等。真核生物:酵母菌,衣藻等。植物用作基因工程受体的有愈伤组织、细胞和原生质体；动物用作基因工程受体的有生殖细胞、胚细胞和癌细胞。目的基因的研究目的基因主要是具有优良性状的基因、致病基因和功能未知的基因。获得途径主要是构建基因组文库或cDNA文库，从中筛选出特殊需要的基因。目前已经获得的目的基因大致分为3类：与医药相关的基因；抗病、虫害和恶劣环境的基因；编码特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。关于基因组测序

1977年，全长5387bp的噬菌体φX174测序完成。——揭开大规模基因组测序工作的序幕1990年，人类基因组计划启动美、英、德、法、日、中（1%）2000年6月，人类基因组工作草图绘制成功

1992年，中国水稻基因组计划

1994年，首次构建水稻基因组BAC全库。1997年，成功构建高分辨率水稻基因组物理图谱。2001年，水稻基因组工作草图绘制完成。基因工程工具酶的研究限制性核酸内切酶：切割连接酶：大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连