外源基因表达调控2

原生质体培养技术植物取嫩叶酶消化细胞壁洗涤2-4次移栽入土

愈伤组织培养基原生质体培养基形成完整植株诱导生芽生根三.转录调控序列对外源基因表达的影响1.高等植物基因的分子结构特点.2.5`-端表达调控序列的基本特征.3.启动子和增强子.(1)组成型启动子:CaMV35S启动子,NOS启动子,其他启动子.(2)诱导型启动子:光诱导型启动子(如SSrbcorrbcS,LHCPa/b),损伤型启动子(如PI-II),其他诱导型启动子(如HSP70,对激素ABA敏感的启动子等)(3)组织特异型启动子:叶特异表达启动子,花粉特异表达启动子,糊粉层特异表达启动子,其他组织特异性启动子.2.诱导型启动子

所谓诱导型启动子就是在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可以大幅度地提高基因转录水平的启动子。该类启动子常以诱导信号命名，如光诱导表达基因启动子；热诱导表达基因启动子；创伤诱导表达基因启动子；真菌诱导表达基因启动子等。诱导型启动子1.光诱导型启动子

二个光合基因启动子SSrbcorrbcS,LHCPa/borCab.

rbcS:例1豌豆rbcS基因一段973bp调节序列和cat基因构成嵌合基因,结果表现出叶绿体依赖性和光调节活性.发现-330—50长度280bp一段DNA对光诱导是必需的.例2rbcS的另一组试验结果都保持了rbcS表达的组织和光调控特异性.当rbcS5`-125--320bp区缺失时,丧失光调控转录活性,称为光反应区(调节区,Lightregulationelement,LRE),I区(GATAAG)G区(CCACGTGG)GT区(GGTTAA)蛋白因子:GA1GBFGT1点突变或缺失处理,使rbcS启动子完全丧失活性.诱导型启动子1.光诱导型启动子

LHCPa/borCab:光调节序列在-347--100之间,这段247bp序列不但有增强子性质,而且也具有沉默子特性.例Pnos-NPTII嵌合基因在转化烟草无论光照与否都能在叶,根中恒定表达.LHCPa/b(427bp)-NPTII则暗条件下叶中基础水平表达,根中不表达;光照下,叶中5-8倍表达,根中不表达.说明LHCPa/b(247bp在叶中具有叶绿体依赖的光诱导增强特性,在根中具有组织特异的沉默子功能.损伤诱导型启动子PI-II:蛋白酶抑制II基因,损伤信号如细胞壁释放的多糖等诱导.例PI-II大约1000bp5`调控区+cat转化烟草叶组织中表现损伤诱导活性.P6B+cat组成嵌合基因无损伤活性只有组成型表达.从而证实PI-II的启动自由RNA5`帽位点-892一段序列组成.PI-II5`-端调控区-892CAPsite糖反应损伤反应++-573+_-453__-520++

-547_±-624__注:Cat为报告基因,除了具有损伤诱导特性外也能被六碳糖,双糖,三糖所激活,有机酸及三羧酸循环代谢物也有为弱作用.损伤反应因子位于序列-573—-624之间.其它诱导型启动子来自果蝇的HSP70基因的热诱导启动子.菜豆的几丁质酶(chitinase)启动子,对真菌侵染敏感.马铃薯块茎蛋白基因I(ClassIPatatin)启动子糖诱导.水稻对激素,ABA敏感的启动子等.(3).组织特异性启动子

也称为器官特异性启动子，在这类启动子的调控下，基因的表达往往只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特性。这种特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为存在的基础。典型的组织特异性启动子有：马铃薯块茎蛋白基因启动子；小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子；番茄果实成熟特异性表达的多聚半乳糖醛酸酶基因启动子；花粉特异表达基因（lat52）启动子和木质部特异表达的苯丙氨酸脂肪酶基因（pal）启动子等。(3)组织特异性(Tissue-specific)启动子

和器官特异性(organspecific)启动子1.叶特异表达启动子LHCPa/b(Cab):光诱导叶组织中特异表达.光合有关的基因，叶绿体特有的基因只在叶片中而且依赖叶绿体才能表达.马铃薯块茎蛋白I基因(ClassIPatatin)启动子具有块茎特异表达和损伤蔗糖诱导活性.马铃薯的叶/茎特异表达基因(ST-LST)的5`上游调控序列与马铃薯块茎结构蛋白基因及3`-末端形成嵌合基因可以在转化烟草的茎叶内特异表达.而该结构蛋白基因通常只在马铃薯的块茎中表达.组织特异性(Tissue-specific)启动子和器官特异性(organspecific)启动子2.花粉特异性表达启动子花药的TA29(1.1Kb)和TA13(1.2Kb)的mRNA互补,绒毡层特异表达.分别在TA29和TA13上游5`端克隆到1.5Kb的启动子片断,分别与GUS融合(PTA29-GUS,PTA13-GUS)转化烟草,检查花药，子房，花瓣，叶，根，茎不同组织表达情况,结果：花药中检测到,而且TA29探针只与花药第二阶段的绒毡层细胞强烈杂交.说明：TA29和TA135`端调控序列有器官，发育特异性,

TA295`端上游含有绒毡层细胞特异表达的全部信息.

组织特异性(Tissue-specific)启动子和器官特异性(organspecific)启动子人工创造雄性不育

TA291.5kbpromoter+黑曲霉RNaseT1或芽孢杆菌RNase(Barnase)融合基因转化烟草,结果转化株与对照相比表型没有差别,但无花粉亦不能结种子,而花柱正常,雌性的育性不受影响.生物学特征表明表型的雄性不育是由于导入TA29-RNaseT1(Barnase),转化植株中的RNase基因在绒毡层细胞内特异地大量表达,从而降低了细胞中的RNA,抑制了绒毡层的形成引起花粉败育,导致雄性不育.组织特异性(Tissue-specific)启动子和器官特异性(organspecific)启动子3.糊粉层特异表达启动子大麦的α-淀粉酶(α-amylase)组分I的基因 通常amy只在发芽大麦的糊粉层表达.（植物激素GA3可诱导其表达,ABA可以抵消GA3的作用）把Pamy+NPTII融合,转化不同来源的原生质体,结果NPTII可以在糊粉层来源的原生质体内低水平表达,GA3可以是表达水平提高10倍,ABA可以抵消GA3的作用;盾片来源的原生质体只能低水平表达,而且不受激素影响;在叶肉原生质体中根本不表达.对照用P35S-NPTII,在三种不同来源的原生质体中都高效表达,而且不受激素的影响.说明Pamy不但具有激素诱导活性而且具有组织特异性.组织特异性(Tissue-specific)启动子和器官特异性(organspecific)启动子大麦的α-淀粉酶(α-amylase)启动子的诱导特性.

大麦原生质体分别来自糊粉层,盾片及叶肉.GA3:赤霉素,ABA:脱落酸.GA3可诱导α-amylase的表达,ABA对GA3有抵消作用.说明：amy启动子不但具有激素诱导活性，而且有组织特异性嵌合基因组构-GA3+GA3+GA3+ABA糊粉层盾片叶肉糊粉层盾片叶肉糊粉层盾片叶肉α-amy-NPTII±±_+±__±_35S-NPTII+++++++++组织特异性(Tissue-specific)启动子和器官特异性(organspecific)启动子4.其他组织特异启动子小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因P.

番茄果实成熟特异性表达PG酶基因启动子.花粉特异表达基因LAT52启动子.木质部特异表达PAL(苯丙氨酸脂肪酶)基因启动子.三.mRNA3`-端非编码区序列对外源基因表达的影响真核生物中:hnRNAmRNA(加帽,加尾)

1.3`-端序列的基本特征 （图） mRNA加尾过程三.mRNA3`-端非编码区序列对外源基因表达的影响3`端调控序列对CAT基因在植物细胞内表达水平的影响通过缺失突变发现位于PI-II终止子Poly(A)信号下游100bp一段含8bp组成的保守序列CGTGTTTT对于基因高效表达是必需的.这段序列广泛存在于动、植物的转录终止子内(YGTGTTYY),这段序列的缺失将极大地影响基因表达水平.

3`端来源5`-端来源马铃薯PI-IIT-DNAgene6BT-DNAgene7马铃薯PI-II高低低CaMV35S高低低9CGTGTCTT15-20

AAUAAA~100CGTGTTTT三.mRNA3`-端非编码区序列对外源基因表达的影响2.不同来源的3`-端序列对外源基因表达的影响.

由P35S-NPTII不同3`端构成的嵌合基因在转化烟草中的转录水平,试验结果为8次平均值表达强弱相差最多60倍.

尽管植物和动物基因3`-端调控序列有许多共同点,但是植物细胞却不能有效地识别动物mRNA的PloyA信号,说明两者之间还存在尚未发现的本质上的差异.3`-端来源长度NPTII相对活性章鱼碱合成酶基因(ocs)320bp12S种子蛋白基因(2S)~650bp1/5rbcS基因(2S)~600bp3伸展蛋白基因(Ext)735bp1/10查尔酮合成酶基因CHS)287bp1/22

不同来源的有着很大影响。使用35S启动子与NPTII结构基因形成共整合体，并于不同来源的终止子构建成融合基因，转化烟草。发现不同的终止子使NPTII基因的表达水平可相差60倍。植物基因的终止密码子多用UGA，而在双子叶植物中，UAA的使用频率高于UGA。四.5`-端内含子对外源基因的表达调控作用1.5`-端内含子的特点.2.5`-端内含子对外源基因表达的促进玉米SHI5`-端内含子,胚乳蔗糖酶基因(6kb)16exon,在启动子后面有一段非编码的外显子,并紧随着一个大的内含子(intronI,1028bp)PexonintronIIintronintron

+1ATG6kb四.5`-端内含子对外源基因的表达调控作用玉米shrunk基因内含子1(shiintron)的存在对cat酶活性表达的影响Sh1promoterintronI(1028bp)catgenecat活性(rice)

58

0

1P35S

数10倍0

1四.5`-端内含子对外源基因的表达调控作用玉米shrunkgene1外显子1(exon1)的作用Promotercatcat在玉米,水稻细胞中的表达活性

1

intronl

100

exoI10

1000shrunkgene1内含子的存在对catgene在烟草植株内的表达有抑制作用.四.5`-端内含子对外源基因的表达调控作用3.作用机理:

5`-端内含子并不具有增强子那样的结构和序列,内含子促进基因表达是通过增加mRNA活性以及提高mRNA含量来实现的.可能还包括增加mRNA稳定性既促进mRNA成熟等作用.五.外源基因在转(翻)译水平的调控1.mRNA结构对翻译的影响

S-D序列(Shine-Dalgarno)核糖体结合位点.原核mRNA翻译起始所必需,细菌中3-9bp组成.在mRNA上与16S核糖体RNA3’端互补，从而控制翻译的起始.真核生物中无此结构,但有帽子到AUG之间的先导序列(leader),可以形成二级结构被核糖体识别,依此来调节翻译的速度。往往二级结构多对翻译不利.五.外源基因在转翻译水平的调控2.翻译增强因子对转录的影响(1)TMVΏ因子来自TMV126KD蛋白基因的转录序列5`-末端的非翻译区,68nt组成.在AUG之前,并有3个8nt组成的重复序列.在AUG前51处,Ώ因子提供了另外一个核糖体结合位点.推测Ώ因子促进mRNA翻译是通过提供一个额外的核糖体结合位点实现的.体外实验证明:5`含Ώ因子的GUS基因的mRNA在烟草细胞内的翻译水平比不用Ώ因子高64倍.