原核生物基因表达调控(新)

第七章原核生物基因表达调控管家基因：是指维持细胞的基本代谢过程所必需的、在不同的细胞类型和细胞生长时期组成型表达的基因。奢侈基因：是指为细胞分化、生物的发育以及生物适应环境所需要的基因，其表达表现出明显的时空调控特性。基因表达的组织特异性：不同组织和器官的细胞，由于其所行使的功能不同，所表达的基因数量和种类也不相同，表现为基因表达的组织特异性。基因表达的阶段性：组织细胞中分化发育的不同时期，基因表达数量和种类也不相同，表现为基因表达的阶段性。基因表达的时空有序性：在生物体发育的不同阶段、不同部位的细胞，开放表达的基因数量、种类和表达强度不一样，合成蛋白质的数量和种类也不相同，显示出基因表达的时空有序性，从而逐步形成形态与功能各不相同、协调有序的组织和器官。一、转录水平的调控二、翻译水平的调控一、转录水平的调控（一）操纵子操纵子(operon)：原核生物基因表达和调控的一个完整单元，包括调节基因，启动子和操纵基因(Operator)及相邻的结构基因。操纵子中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因(structuralgene)。一个操纵子中含有2个以上的结构基因，多的可达十几个。每个结构基因是一个连续的开放阅读框(openreadingframe)，5’端有起始密码ATG，3’端有终止密码TAA、TGA或TAG。各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群。结构基因群操纵子的基本组成启动子（promoter）能被依赖于DNA的RNA聚合酶所识别的碱基顺序，是RNA聚合酶的结合部位和转录起点，在许多情况下还包括促进这一过程的调节蛋白结合位点。操纵基因（operatorgene）是指能被调控蛋白特异性结合、并影响基因转录的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子序列重叠。以前将操纵区称为操纵基因（operatorgene）。但现在基因定义是为蛋白质或RNA编码的核酸序列，而操纵序列并不是编码蛋白质的基因，却是起着调控基因表达强弱的作用，正如启动序列不叫启动基因而称为启动子一样，操纵序列就可称为操纵区。operon译为操纵子，即基因表达操纵的单元之意。调控基因（regulatorygene）是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。根据基因所编码的调控蛋白可分为：阻遏蛋白（repressiveprotein）：是与操纵子结合后能减弱或阻止结构基因转录的调控蛋白。激活蛋白（activatingprotein）：与操纵基因或位于启动子上游的控制因子结合后能增强或启动结构基因转录的调控蛋白。根据操纵子对调控蛋白的反应：正调控：调节蛋白不存在时基因是关闭的，调节蛋白出现后基因的活性被开启。如乳糖操纵子中CAP蛋白与启动子的结合。负调控：调节蛋白不存在时基因是表达的，调节蛋白出现后基因活性被关闭。如阻遏蛋白与操纵子的结合。效应物（effector）：操纵子的开启和关闭均受到环境因子的诱导，这种因子能与调控蛋白结合，改变调控蛋白的空间构象，从而改变其对基因转录的影响，因此这种因子称为效应物。诱导物（inducer）：凡能诱导操纵子开启的效应物。辅助阻遏物（corepressor）：凡能导致操纵子关闭，阻遏转录过程发生的效应物。根据操纵子对效应物的反应：可诱导操纵子：诱导物，负责物质的分解，如乳糖操纵子可阻遏操纵子：辅阻遏物，负责物质的合成，如色氨酸操纵子终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵子中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。终止子不依赖ρ因子依赖ρ因子的终止子终止子至少可以分为两类：乳糖操纵子第一个被发现的操纵子。乳糖操纵子含有一个调控基因（I），一个启动子（P），一个操纵基因（O）和受操纵基因调控的3个乳糖代谢相关基因Z、Y和A。大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先利用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间的适应，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长。在正常情况下，E.coli是以葡萄糖作为碳源的，在没有葡萄糖，只有乳糖存在的条件下，E.coli也能以乳糖为碳源而生存。葡萄糖是单糖，E.coli利用它最为方便和经济。乳糖是双糖，是葡萄糖和半乳糖的复合物。以乳糖为碳源必须先将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，再将半乳糖转化为葡萄糖，这就需要额外的酶。大肠杆菌二阶段生长现象大肠杆菌利用乳糖至少需要两个酶：促使乳糖进入细菌的乳糖透过酶

----lactosepermease催化乳糖分解第一步的

－半乳糖苷酶

----galactosidase在环境中没有乳糖或其他β-半乳糖苷时，大肠杆菌合成β-半乳糖苷酶量极少，加入乳糖2－3分钟后，细菌大量合成β-半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上。这种典型的诱导现象，是研究基因表达调控极好的模型。针对大肠杆菌利用乳糖的适应现象，法国的Jocob和Monod等人于1961年提出乳糖操纵子（lacoperon）学说。β-半乳糖苷酶（lacZ），将乳糖分解成半乳糖和葡萄糖。半乳糖渗透酶（lacY），一种在细胞膜的运送蛋白质，负责将乳糖逼入细胞中，帮助细菌从培养基中摄取乳糖。半乳糖苷转乙酰酶（lacA），将乙酰基从乙酰辅酶A转移至β-半乳糖苷。乳糖操纵子的负调控当有乳糖存在时，乳糖受

-半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，与调节蛋白结合，使其构象变化，R四聚体解聚成单体，失去与ｏ的亲和力，与ｏ解离，基因转录开放。乳糖操纵子的正调控ATPcAMP腺苷酸环化酶CAP（catabolite-activatingprotein）是cAMP的受体蛋白cAMP-CAP复合物是乳糖操纵元的正调控因子。当cAMP-CAP复合物与位于乳糖操纵元启动子区域的CAP结合序列相结合时，使启动子区域的DNA序列弯曲成新的构型，这种新构型有利于提高RNA聚合酶的工作效率。当细胞中既有别乳糖与阻遏蛋白结合，又有cAMP-CAP复合物与启动子DNA序列结合时，乳糖操纵元的转录效率最高。但是，当细胞内有葡萄糖存在时，葡萄糖抑制腺苷酸环化酶的活性，不能形成cAMP，使得细胞中cAMP的水平下降，CAP不能与cAMP形成复合物，就不能与CAP结合序列结合，这样就降低转录效率。由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵子转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。lac操纵子的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。通过这机制，细菌是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。细菌对葡萄糖以外的其他糖（如阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖等）的利用上也有类似对乳糖利用的情况，在含有编码利用阿拉伯糖的酶类基因群的阿拉伯糖操纵子（araoperon）、半乳糖操纵子（galoperon）中也有CAP结合位点，CAP也起类似的正调控作用。乳糖操纵子调控的渗漏现象乳糖操纵子不是完全彻底地关闭着，即存在调控的渗漏现象。乳糖操纵子基因在极低水平上表达，合成相应的酶，将痕量的乳糖转变成异构乳糖。乳糖类似物取代半乳糖苷这些化合物主要是取代半乳糖苷，乳糖的葡萄糖部份被其他官能团所取代，不受

-半乳糖苷酶的催化分解，却也能与调节基因特异性结合使调节基因构象变化，诱导lac操纵子的开放。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）：是经常被用来作为乳糖操纵子的诱导物。IPTG与阻遏基因结合并使之不活跃，但却非β-半乳糖苷酶的底物。IPTG在体内研究的一个优点是它不能被大肠杆菌所代谢，它的浓度在实验中并不会改变。再者，IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被运送。指示剂有些化合物可作为β­半乳糖苷酶活动的颜色指示剂：邻硝基苯基-β­D­半乳糖苷（ONPG）：会被分开来产生黄色的化合物：邻硝基苯基。它一般会被用来作为β-半乳糖苷酶试管分析的底物。5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷（X-gal）：会将产生β-半乳糖苷酶的细菌转为蓝色。1---5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole2---5,5’-dibromo-4,4’-dichloro-indigo，aninsolubleblueproduct克隆质粒含LacZ基因，该酶能分解生色底物X-gal产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入LacZ基因后失活，菌株呈白色，称之为蓝-白斑筛选。IPTG和X-gal常被用作基因工程的蓝-白斑筛选：色氨酸操纵子色氨酸是构成蛋白质的组分，一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵子（trpoperon）的调控。实验观察表明：在色氨酸阻遏与除阻遏状态下，Trp操纵子的表达水平相差600倍，然而阻遏作用仅使转录水平降低70倍。这种调控现象与色氨酸操纵子特殊的结构有关。（二）衰减子系统mRNA前导区序列分析trp前导区的碱基序列已经全部测定，发现完整的前导序列可分为1、2、3、4区域，这四个区域的片段能以两种不同的方式进行碱基配对。当色氨酸浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，3-4区可以自由配对形成茎-环式的终止子结构，使得只有约10％的RNA聚合酶能继续参与色氨酸操纵子结构基因的转录。在无色氨酸存在时，所有转录Trp操纵元的RNA聚合酶都可以通过衰减子。当有色氨酸存在时，一部分RNA聚合酶逃过阻遏蛋白的监督起始转录；而这些RNA聚合酶在衰减子处大部分被扣留，而只有10%的RNA聚合酶可以通过。由此可见，弱化子对RNA聚合酶转录的终止依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置，而细胞中色氨酸存在与否，决定了mRNA转录的弱化子结构，使弱化子中1、2、3、4区域呈现竞争性配对，从而产生弱化效应，这是色氨酸操纵子第二水平调控的机制。应该指出，色氨酸含量变化对阻遏过程和弱化过程的作用方向是相同的。前者主要控制操纵子基因表达的启动，而后者主要决定转录和翻译是否能继续进行下去。精氨酸合成酶操纵子在操纵子调控中，有时一个调控基因可调控多个操纵子的表达，将受控于同一个调节蛋白的多个操纵子，称为调节子（regulon）。精氨酸合成途径所需要的酶类分别由多个基因编码，并分布于5个操纵子中，而这5个操纵子却受1个调节基因R的调节。AGRDBCEHFArg（二）RNA聚合酶控制的转录时序σ因子识别启动子:原核RNApol的σ70因子识别大多数基因的启动子，多个σ因子参与不同基因的转录起始，其亲和性不同，如热激蛋白为σ32，枯草杆菌(B.subtilis)为σ55，B.subtilis不同发育阶段基因表达亦通过σ因子的更替来控制噬菌体的基因时序表达。σ因子控制时序表达抗终止因子的调节作用T7RNA聚合酶控制时序表达E.coliRNA聚合酶:噬菌体T7感染后其早期基因表达由E.coliRNA聚合酶转录，合成T7RNA聚合酶(早期Ⅰ基因)。T7RNA聚合酶:晚期Ⅱ/Ⅲ类基因由T7RNA聚合酶转录，合成T7噬菌体DNA复制有关的酶类及噬菌体颗粒结构蛋白，晚期Ⅲ基因的启动子不同于E.coliRNA聚合酶转录控制表达的基因启动子，无-35和-10共同序列。二、翻译水平的调控反义RNA（antisenseRNA）的调控作用反义RNA通过与特定的mRNA结合，结合位点通常是mRNA上的SD序列及N端的密码子，从而抑制mRNA的翻译。反义RNA调控的两种机制：与核苷酸序列形成双链区，直接阻碍其功能，如翻译起始。在靶分子的部分区域形成双链区，改变其他区域的构象，直接影响其功能。大肠杆菌中存在两种膜蛋白OmpC和OmpF，当渗透压高时，OmpC的产量增加，OmpF的产量受到控制，而在低渗透压时则相反。但两个基因并不连锁，却受到培养基渗透压的控制。EnvZ基因编码一种作为渗透压感受器的受体蛋白，当渗透压增加时，EnvZ激活OmpR的产物（一种正调节蛋白）。OmpR可以激活OmpC和调节蛋白micF两个基因转录，这两个基因相互连锁但反向转录。大肠杆菌膜蛋白的调控1995年康乃尔大学的SuGuo的实验：反义RNA阻断美丽线虫(C.elegans)的par-1基因表达，以正义RNA为对照，但结果发现反义和正义RNA都阻断了该基因的表达。无法解释该现象。1998年华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学医学院的CraigMello发现基因抑制是由于试验中污染了双链RNA而引起的，并证明单链RNA所引起的阻断作用十分微弱，而经纯化的双链RNA则能高效特异地阻断相应基因的表达，他们将此称为RNA干扰。并由此获得诺贝尔奖。RNAi的发现与证实RNAi是指一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。小干扰RNA---smallinter