子宫内膜腺上皮细胞的分离培养及细胞活性评估

子宫内膜腺上皮细胞的分离培养及细胞活性评估

人子宫内膜由表皮、腺体上皮、间质细胞、血管平滑肌细胞和炎症细胞组成。大多数是腺上皮和间质细胞。通过外部分离和培养，子宫内膜中不同成分的刺激反应之间的边界可以避免。这是研究内膜疾病的主要方法之一1.2。目前国内外有很多培养原代子宫内膜细胞的方法,但分离步骤较多,获得的腺上皮细胞纯度低、易污染,细胞存活时间短,影响后续的机制学研究［3－4］。本研究拟探讨一种既简单又可获得高纯度大量子宫内膜组织腺上皮细胞的方法,为研究子宫内膜细胞生长、分化、代谢及激素作用机制提供一种理想的体外实验模型。1数据和方法1.1患者性别、年龄选取2012年3月-2012年12月在宁夏医科大学总医院妇科因子宫腺肌症,行经腹全子宫切除患者的子宫增殖晚期及分泌期内膜组织标本10份,年龄在28~48岁,平均(40.40±4.35)岁,无内科合并症,月经规律,术前3个月内未用过雌孕激素治疗,术前经医院伦理委员会批准,征得患者同意并签署知情同意书。术中取下无菌新鲜的子宫内膜组织立即置入冰浴的含血清及双抗DMEM/F-12培养液(含青霉素100U·mL－1、链霉素100U·mL－1)小瓶中,尽快(<2h)进行分离培养。所有子宫内膜均经病理证实为子宫腺肌症,且证实为增殖期或分泌期子宫内膜.1.2动物免疫酶pa培养液:双抗+15%胎牛血清培养液(DMEM/F12培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司);消化液:0.2%胶原酶IV型(Sigma公司);细胞鉴定:鼠抗人波形蛋白(vimentin)抗体、鼠抗人细胞角蛋白(cytokeratin)抗体(稀释比例1∶100)购自美国Protech公司。PV-6000、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗小鼠抗体均购自北京中杉金桥生物公司;MTT试剂盒(凯基生物)。1.3消化液消化阶段1.3.1子宫内膜腺上皮细胞的分离培养［5－6］子宫内膜标本尽快(<2h)分离培养。每例子宫内膜组织均采用室温酶解结合差速离心法(改良组)和传统水浴消化(对照组)两种方法分离培养子宫内膜腺上皮细胞。具体步骤:含抗生素的含血清的细胞培养液彻底清洗内膜,去除血污,组织块剪碎呈肉糊状,自然沉淀,弃去洗液;加入3倍体积的0.2%胶原酶Ⅳ,混匀,分装入两个离心管。1)改良组:室温(25℃)反复轻轻吹打消化,持续10min,倒置显微镜下观察游离细胞数,自然沉淀,将上清液吸出移入无菌离心管中,终止消化。剩余组织块重复上述步骤2次,共消化30min;消化液低速离心洗涤(500r·min－1,1min),离心后收集沉淀,上清转入另一离心管,重复离心,共3~5次(500r·min－1,1min)。2)对照组:37℃水浴消化,每5min间断摇晃持续30min,吸出消化液,剩余组织块继续消化约30~40min;消化液中加入培养液终止消化,重悬,100目、400目筛网过滤,反冲400目筛网,收集细胞团,离心(500r·min－1,5min)。分离所得的两组细胞悬液离心,弃上清收集沉淀、重悬细胞,置于37℃、5%CO2孵育箱中培养,接种1~1.5h后将悬浮的上皮细胞团吸出转入新的培养皿、板接种培养,72h后第一次换液,此后每隔2d换液一次,每日用倒置显微镜观察细胞形态和生长情况。1.3.2细胞计数差速贴壁后,将两组细胞悬液分别收集于50mL离心管中,各组分别取1mL细胞悬液离心5min后,弃上清在沉淀中加入0.25%胰酶37℃消化10min成单细胞悬液,计数板进行计数;细胞以1×105·mL-1接种于24孔板,铺7块板,每块板设两个组、每组设3个复孔。1.3.4细胞鉴定的方法①免疫细胞化学鉴定:取分离纯化出的细胞悬液,滴入预先置有盖玻片的6孔板中,进行细胞爬片。于第7天用无水乙醇固定细胞10min。滴加一抗(鼠抗人细胞角蛋白多克隆抗体)4℃孵育过夜;滴加二抗(PV6000),DAB显色。凡细胞质被染成棕黄色的为阳性。②免疫荧光化学:用荧光素标记山羊抗小鼠IgG代替免疫细胞化学中的二抗进行染色。染色后,在荧光显微镜下用绿色激光激发并摄片,阳性细胞的细胞质呈绿色,阴性细胞的细胞质不显色。1.4细胞纯度、计数及活性值比较采用SPSS16.0软件进行统计学分析,改良组和对照组分离的细胞纯度、计数及活性值满足正态分布,实验结果均以(ue0af±s)表示,组间比较采用独立样本t检验,P≤0.05为差异有统计学意义。2原代莲子内皮腺上皮细胞分离方法2.2.1两组子宫内膜腺上皮细胞形态学特点两组所得细胞均在第3天贴壁完全,细胞外形无明显差别;细胞生长第3天(图1A,见封3),成团的细胞呈漩涡状生长,细胞呈多角形或蝌蚪形,核大、细胞之间连接紧密且常围绕成细胞小团;视野中未见扁平、纺锤状的基质细胞;细胞生长第5~6天(图1B,见封3),细胞生长旺盛,细胞团之间逐渐融合成多角形铺路石,胞浆呈裙边状;对照组细胞于第10天左右出现包浆浓缩,核固缩,于12天左右细胞逐渐出现死亡,从瓶壁脱落。改良组细胞于13天左右才开始逐渐出现细胞死亡。2.2两种原代子宫内膜腺上皮细胞分离方法结果的比较差速贴壁2h后,收集细胞悬液接种,各组取1mL细胞悬液细胞计数板计数,改良组可得到(9±1.7)×107个腺上皮细胞;对照组可得到(3.9±0.78)×107个腺上皮细胞,两组差异有统计学意义(P<0.05)。2.3两种分离方法子宫内膜腺上皮细胞的纯度鉴定子宫内膜腺上皮细胞的特异性标志分子为细胞角蛋白(cytokeratin),本实验分离培养的子宫内膜腺上皮细胞角蛋白染色阳性。每张细胞片取10个不同视野进行上皮细胞计数,计算细胞纯度,改良组腺上皮细胞纯度可达(97.8±0.002)%,高于对照组腺上皮细胞纯度(88.6±0.006)%(P<0.05),见图2、3(封3)。2.4MTT法检测细胞活性两组细胞在不同时间点的OD450值在3~7天随时间增加而升高。接种培养的两组细胞均于第3天贴壁完全,且两组之间OD3值差异无显著性,两组细胞均于第6天进入对数生长期,第7天达到高峰,以后增殖速度减慢进入平台期,两组细胞生长曲线见图4,均成“S”形。两组细胞于第6天开始,改良组OD450明显高于对照组OD450(P<0.01),即改良组分离得到的腺上皮细胞的生长速度及活性明显高于对照组(P<0.01)。3离心分离法和筛网法分离3.1子宫内膜细胞体外培养在妇产科疾病研究中的意义目前对子宫方面疾病,如子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)、子宫肿瘤等的研究可分为三种类型:人体试验、动物模型及细胞模型。由于伦理学问题,人体疾病的临床实验研究,尤其是创伤性检查和早期药物试验,很难在人体进行,而动物模型,目前应用较多的是灵长类动物,但由于其价格昂贵,较难应用于临床。因此,应用子宫内膜细胞分离及培养技术,建立人子宫内膜细胞体外培养模型,可广泛应用于妇产科领域,可对胚胎着床、月经调节机制和子宫内膜异位症发生机制等进行基础研究,并且可为研究药物作用机制及肿瘤发生提供有效的手段［7－8］。3.2子宫内膜细胞体外培养现状体外培养在位子宫内膜报道主要有两种方法,即筛网分离法和离心法[9-14],筛网法是利用腺上皮细胞成团,体积大等特点,经不同孔径的滤网过滤将未消化的组织团块、成团的腺细胞和单个间质细胞有效地分离开,但步骤繁琐,容易导致污染;传统的离心分离法中离心转速较高,最高时达1200r·min-1,高转速及离心次数的增多,促使细胞的损伤增强,而细胞的破坏也可造成培养成功率的下降。谭先杰和李傲等等报道,利用多次过滤及重力沉降法,得到腺上皮细胞纯度约90%,间质细胞纯度达95%以上,但该方法操作步骤较为复杂,增加了污染的可能性。张宏等采用离心法和筛网法分离培养在位和异位内膜组织,结果显示,离心法培养的在位和异位内膜细胞成功率分别为61.11%和30%;筛网法培养的在位和异位内膜细胞中,成功率分别为83.13%和77.18%。综上所述,采用室温酶解反复吹打消化和改良式差速离心进行子宫内膜原代的分离和培养,可以获得纯度较高、数量较多的子宫内膜腺上皮细胞。本试验方法简便,可减少操作复杂带来污染的可能性,获得的子宫内膜腺上皮纯度及活性均高,可用于体外建立较理想的子宫内膜细胞培养模型。1.3.3MTT检测细胞生长曲线分别于细胞接种3、4、5、6、7、8、9d取出一块板检测。吸尽孔内液体,PBS冲洗3次,每孔加入MTT0.3mL,继续孵育4h,吸去含MTT培养液,加入DMSO400μL溶解细胞,分200μL吸入96孔板,酶标仪测定OD490值。利用作图软件Excel,以两组细胞在不同时间点的OD值绘制细胞生长活性曲线3.3改良筛网法在子宫内膜细胞分离培养中的优势本研究对众多分离方法加以总结改良,首先选用0.2%胶原酶Ⅳ多次室温反复轻轻吹打消化(30min),所得细胞数及细胞活性较水浴消化明显提高,并且简化了步骤,避免了污染。主要是因为多次消化结合反复吹打,使酶与组织接触充分,组织消化完全,缩短了消化时间,避免了酶长时间接触对先消化下来的细胞的损害。本实验中所得细胞存活时间达半月。其次,利用低速离心或重力沉降,该法根据腺上皮细胞和间质细胞在细胞悬液中所具有的重力差异分离两种细胞,为了提高细胞数量,采用多次梯度离心的方法纯化细胞,克服了高转速、长时间离心对细胞的损害,同时将间质细胞和血液红细胞逐步分离,在短期内获得