柱相色谱法分离酮康唑的研究

柱相色谱法分离酮康唑的研究

身体蛋白质的组成包括氨基酸、糖和其他代谢过程中的酶、受体和载体。当外包药物进入生物体时，它们的反应方法与不同的分子识别反应相同。因此，这两种药物通常具有不同的药理作用，它们的代谢路径和受体选择也不同。换句话说，存在三维选择性。目前,临床上常用的2000余种化学药物中,手性药物约占40%,单一对映体药物不足100种;大多数药物以外消旋体形式供药用,因此研究高分离效能、高灵敏度的手性药物拆分和测定方法对提高药效和控制药物质量具有重要的现实意义。酮康唑(ketoconazole,KTZ)是一种广谱抗真菌口服药物,尽管酮康唑有两个手性中心,但这两个手性中心上的氢原子和2,4-二氯苯基都在二氧戊环的同侧,存在较大的空间位阻,因而酮康唑只有一对对映体,其结构如图1所示。研究表明,它的两个对映体具有不同的药理活性,左旋酮康唑比右旋酮康唑的药理活性高2～4倍。目前临床上以外消旋体供药,因此研究酮康唑的手性拆分方法对研究其药理和药效作用都具有重要的意义。Castro-Puyana等和Crego等用毛细管电泳技术对酮康唑进行了手性拆分,流动相中含0.1mol/L磷酸盐(pH3.3)、20.0mmol/L七(2,3,6-三-O-甲基)-β-CD,前者在11min内两个对映体达到基线分离,分离度为6.0;后者在7min内两个对映体达到基线分离,分离度为5.2。Toribio等用超临界流体色谱法,以CO2作为流动相,分别用ChiralpakAD手性柱(多糖的羟基被3,5-二甲基苯基氨基甲酸盐取代后作为手性固定相)和ChiralcelOD手性柱(纤维素的羟基被3,5-二甲基苯基氨基甲酸盐取代后作为手性固定相)成功分离了酮康唑对映体。Bernal等分别用ChiralpakAD手性柱和ChiralcelOD手性柱对酮康唑进行了拆分,流动相组成为醇类(甲醇、乙醇或2-丙醇)和水,保留时间都超过60min。但未见采用手性流动相添加法拆分酮康唑对映体的报道。本文采用反相C18键合固定相,在流动相中添加手性选择剂,实现了酮康唑对映体的拆分,并对影响酮康唑手性拆分的主要因素(如环糊精的种类和浓度、流动相pH值、柱温以及甲醇和磷酸盐溶液的体积比等)进行了研究。结果表明,采用磺丁基-β-环糊精(SBE-β-CD)作为手性流动相添加剂,可以成功地拆分酮康唑外消旋体,分离效果好,方法简便,对于酮康唑手性拆分具有应用价值。1实验部分1.1精密旋光仪测定LC-10ADvp高效液相色谱仪(日本岛津公司);TL-9900色谱工作站;FA1104N电子天平(上海精密科学仪器有限公司);pHs-2C型酸度计(上海伟业仪器厂);WZZ-2B自动旋光仪(上海精密科学仪器有限公司)。酮康唑外消旋体(西安杨森制药公司提供);SBE-β-CD、磺丁基-羟丙基-β-环糊精(SBE-HP-β-CD)、羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)(南京师范大学江苏省医药超分子材料及应用重点实验室提供);β-CD(国药集团化学试剂有限公司);磷酸二氢钠(化学纯,上海凌峰化学试剂有限公司);浓磷酸(化学纯,南京化学试剂厂);甲醇(色谱纯,山东禹王实业有限公司);三乙胺(化学纯,上海金山亭新化工试剂厂);实验用水均为重蒸水。1.2供试品溶液配制的配制:精密称取酮康唑适量,用甲醇溶解并制成质量浓度约为1.00g/L的贮备液,再用流动相稀释成5.00mg/L的供试品溶液,在4℃下保存。1.3磺丁基--环糊精的将酸钠某品牌色谱柱:DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm,5μm,迪马公司)。流动相:甲醇-0.02mol/L磷酸二氢钠(体积比为60∶40,含1.0mmol/L磺丁基-β-环糊精及0.02%三乙胺,稀磷酸调节pH3.00);流速:1.00mL/min;检测波长:225nm;进样量:20μL。使用前,流动相经0.45μm有机滤膜过滤并超声脱气。2结果与讨论2.1手性添加剂的选择本实验以SBE-β-CD、β-CD、HP-β-CD、SBE-HP-β-CD作为手性选择剂,分别考察了它们对酮康唑对映体手性分离的影响。由图2可见在相同条件下,只有SBE-β-CD可使酮康唑对映体完全分离,而β-CD只能部分拆分酮康唑对映体,HP-β-CD和SBE-HP-β-CD均不能拆分酮康唑对映体。这可能是由于酮康唑的苯环进入SBE-β-CD的疏水空腔,形成范德华力;酮康唑的氧原子和SBE-β-CD的羟基形成氢键;而酮康唑含有哌嗪基显碱性,在实验的pH条件下带正电荷,而磺丁基带负电荷,产生静电作用相互吸引;这3种因素的共同作用使得SBE-β-CD和酮康唑对映体形成了稳定程度有异的包结物,因此成功拆分了酮康唑对映体。β-CD分子像个无底的桶,其中2位和3位上的羟基在空腔的大口端,6位上的羟基在空腔的小口端。2位上的羟基相对于环糊精空腔是朝外的,对环糊精的手性选择几乎没有影响;3位上的羟基的方向与环糊精的轴线几乎平行,所以3位上的取代基的性质对环糊精的立体选择性影响最大;6位上的取代基的性质主要影响环糊精分子的形状,如果在6位上引入极性小、体积大的基团,会使环糊精分子的小口端变大,而大口端变小。若SBE-HP-β-CD的磺丁基和羟丙基取代发生在3位的羟基上,则由于空间位阻作用,使酮康唑进入环糊精的空腔困难,导致手性匹配性差,这可能是其不能很好地拆分酮康唑对映体的原因。而HP-β-CD和β-CD是中性的,不能和酮康唑形成静电作用,所以拆分效果也不理想。因此实验选择SBE-β-CD作为手性添加剂。实验进一步考察了SBE-β-CD的浓度对酮康唑对映体手性分离的影响。从图3可见,酮康唑对映体的分离度随着SBE-β-CD浓度的增加而增大,同时保留时间也增加。这是因为SBE-β-CD浓度的增加增强了其与对映体之间的相互作用,使对映体之间的色谱行为差异扩大,因此提高了分离度。考虑到增加SBE-β-CD的浓度影响色谱柱的使用寿命,同时保留因子也会增大,保留时间延长,柱效降低,所以本文选择SBE-β-CD的浓度为1.0mmol/L。2.2ph值对sbe--cd分离度的影响在手性拆分过程中,pH值是一个重要参数。在其他条件不变时,酮康唑对映体在pH值2.70～5.00范围内可以达到基线分离。由表1可见,酮康唑两个对映体的分离度和保留因子在此范围内均随着pH值的增加而增大。这可能是因为当pH值比较低时,SBE-β-CD2位上的羟基质子化,不能和酮康唑的氧原子形成氢键,使手性匹配性较差;而当pH值增大时,2位上的羟基的质子化程度减小,使手性匹配性增加,分离度也相应增大。酮康唑是一种弱碱,pH值增加,其电离受到抑制,使分子的极性降低,在反相色谱柱上的保留增强,保留因子相应增大。当pH>5时,酮康唑对映体在反相色谱柱上的保留时间在1h以上,拆分效率明显降低。故本文最终选择pH为3.00。2.3增加甲醇的比例流动相中甲醇的比例对拆分效果的影响很大。由表2可以看出,增加甲醇的比例可以使酮康唑对映体的保留因子减少,同时分离变差。这可能是由于甲醇与酮康唑对映体竞争流动相中的磺丁基-β-环糊精的疏水空腔,使得分离度减小。2.4色谱条件选择磺丁基-β-环糊精和酮康唑对映体分子形成包结物是一个放热的过程,因此降低温度会抑制酮康唑分子的振动和转动,增加包结物的稳定性和分子之间的手性匹配,所以降低温度对手性拆分有利,结果见图4。但是柱温太低会增加流动相的黏度,使色谱系统柱压过高。综合考虑以上因素,最终选择柱温为30℃。综上所述,手性拆分KTZ对映体的最佳的色谱条件如“1.3”节所述。在优化的色谱条件下酮康唑对映体的分离结果见图5,由此可见在6min之内就可使酮康唑对映体分离,分离度达2.05。2.5酮康唑出峰酮康唑单一对映体的对照品很难获得,迄今未见对酮康唑对映体进行定性的相关研究报道。本文分别收集两个对映体峰的流出液,测定其旋光方向,测得先后两峰流出液分别呈左旋和右旋,即(-)-2S,4R-酮康唑先于(+)-2R,4S-酮康唑出峰。原因可能为流动相中的磺丁基-β-环糊精是由7个D(+)吡喃型葡萄糖残基经α-1,4-糖苷键结合并由磺丁基衍生化而形成的,根据“三点作用”分离理论,当它和右旋酮康唑相互作用时,右旋酮康唑的苯环、氧原子和哌嗪基分别和磺丁基-β-环糊精的空腔、羟基和磺丁基相互匹配,形成比较稳定的包结物,而左旋酮康唑无论怎样旋转,最多有两个基团可以和磺丁基-β-环糊精相应的基团相互作用