免疫金标记技术的研究

免疫金标记技术的研究

免疫金标记是一种将金溶胶用作标记的新免疫标记技术。该技术简单易用。已经成为继荧光素、酶和阴离子等标记技术之后的一种新检测技术。金标抗体检测将反应载体和信号输出融为一体，其稳定性和柔软性决定了检测方法的稳定性和检测限制。我们是基于研究纳米颗粒和受体之间的相互作用，确定了阐明这些相互作用的机制，为提高该方法的灵敏度和稳定性奠定了基础。本文以纳米金溶胶和AFB1单克隆抗体McAb为材料,研究了标记过程和标记条件,获得了稳定、灵敏的免疫金标AFB抗体探针.并且通过透射电镜、紫外-可见光谱、红外光谱、圆二色谱、荧光光谱等手段分析了标记前后金溶胶和抗体蛋白的结构和构象变化,为揭示纳米金与抗体蛋白之间的作用机理提供突破点.1实验部分1.1仪器和检测方法Spectronic1.70GBC紫外-可见光分光光度计(意大利),HitachiH7000,透射电镜(日本),RCTIKA磁力搅拌器(德国),Nicolet5DXC红外光谱仪(美国),岛津RF-5301PC荧光光谱仪(日本),J-500C圆二色谱仪(德国),CentrikonT-124高速冷冻离心机(瑞士).1.2实验过程1.2.1金溶胶抗体蛋白实际用量的测定向5mL金溶胶溶液中加入1mL不同浓度的抗体蛋白溶液,充分混匀.5min后加入质量分数为10%的氯化钠溶液1mL,然后分别测定520nm和580nm的吸光值A,以A520-A580为纵坐标,蛋白质用量为横坐标作一曲线,取曲线拐点处的蛋白质用量为最小保护剂量,在此基础上再加20%为稳定金溶胶的抗体蛋白实际用量.1.2.2金溶胶的纯化取一定体积的金溶胶溶液,在磁力搅拌的同时,缓慢滴加0.1mg/mLMcAb溶液(将McAb溶于0.01mol/LpH=7.4的PBS缓冲液中).金溶胶的浓度为[Au]=2.4×10-5mol/L.静置0.5h后通过2次4℃冷冻和超速离心进行纯化.首次离心转速10000r/min,时间45min,弃去上清液,沉淀用质量分数为10%的BSA溶液溶解,进行第二次离心;第二次用质量分数为10%～30%的甘油密度梯度离心,转速7000r/min,时间45min,用于除去未标记的蛋白和金颗粒聚集体,收集中间红褐色部分备用.1.2.3纳米金颗粒物理性能对获得的纳米金抗体复合物进行TEM测试,测定纳米金颗粒复合物的颗粒形态、直径和均匀度,用统计学处理所测的50个金颗粒,计算平均直径和标准偏差.1.2.4mcab抗体的免疫活性测定采用间接竞争ELISA方法测定McAb抗体标记前后的效价和亲和常数.稳定性分析根据不同贮藏时间(常温,25℃)McAb抗体的免疫活性保存率来评价.以ELISA阴性孔(不含AFB1)和阳性孔(AFB1质量浓度为1ng/mL)吸光度差值表示McAb抗体的免疫活性.贮藏过程中,测定值与初始值之比为免疫活性的保存率(%).每10d测定一次,共贮藏60d.1.2.5荧光光谱的测定固定McAb的量,加入不同浓度的纳米金溶胶(Au浓度介于3～30μmol/L之间),检测体系的荧光光谱.所用的激发和发射光谱带宽均为1.5nm,狭缝宽度为1nm,激发光波长为280nm,测得荧光发射光谱,再以Δλ=15nm和Δλ=60nm测定样品的同步荧光光谱.1.2.6色谱分析测试分别对McAb和McAb与纳米金溶胶复合物进行圆二色谱分析,测试范围190～300nm,测试温度25℃,扫描速度100nm/min,扫描步长0.1nm,扫描带宽1.5nm.2结果与讨论2.1最佳ph值及用量的确定金溶胶在500～550nm之间有强的吸收峰,是金纳米粒子的表面等离子体共振吸收峰.由图1可知,随着McAb加入量的逐渐增加,在520nm附近的等离子体吸收峰的强度逐渐降低,推测McAb与金纳米粒子发生了相互作用.当McAb量逐渐增多时,吸收峰降低并逐渐平缓,这表明抗体上的金颗粒结合位点达到饱和.图2显示,与McAb作用后,前5min内的金溶胶等离子共振吸收峰降低最明显,5min后趋于稳定,作用16h时,吸收光谱仍没有明显变化.表明McAb与金纳米粒子之间的作用在5min内基本完成,并且作用后的结合物相对稳定.不同pH(pH=4.5,6.0,7.5,8.0,9.0,10.0)条件下,金纳米粒子与McAb蛋白作用后,其共振吸收峰降低的趋势与280nm的吸收峰升高的趋势是一致的,除了pH=4.5时的共振吸收峰发生大幅度的展宽和红移之外,其它pH下的吸收峰之间不存在明显差异.推测是因为pH=4.5时对金溶胶的稳定性产生了破坏作用.抗体蛋白质是两性电解质,在不同pH值的溶液中具有不同的电荷状态,在等电点处容易发生沉淀(一般等电点pH为5左右).黄曲霉毒素抗原抗体的特异性结合必须在合适的pH值(6～9)环境下进行,pH值过高或过低将影响抗原和抗体的理化性质.不同pH条件下金溶胶标记AFB1单抗McAb在520和580nm的吸光度结果表明,在pH=7.4时金溶胶标记物吸光值之差最大,标记产物最稳定.当金浓度为2.4×10-5mol/L时,随着金颗粒直径的增大,McAb蛋白的实际用量降低,结果见表1.2.3金属元素和金属酶标记的免疫特性在金标探针体系中存在各种直径近似的颗粒混合体,同时还混有未参与标记的过量抗体成分.为得到更均匀的金溶胶颗粒,采用甘油密度梯度离心,经分级后制得探针颗粒直径的变异系数(CV)小于25%,离心后所得金复合物颗粒标准偏差为3.05nm,变异系数小于25%,但无法通过透射电镜判断McAb与金颗粒的作用位置和作用方式.标记前后红外光谱的特征吸收并未发生明显改变,表明标记过程没有改变抗体蛋白的特征官能团.通过ELISA方法比较标记前后抗体的免疫特性,与未标记抗体相比,金标复合物的抗体亲和力从原来的3.81×107提高到4.14×107,抗体效价也从2.00×105提高到2.20×105(测定次数为3次).研究结果还显示,经纳米金标记后,抗体稳定性增加,于37℃贮藏60d后,抗体的热稳定性从原来的42%提高到53%.2.4荧光能量转移的机制荧光法是研究生物大分子相互作用的重要手段.固定McAb的量,改变金溶胶浓度,McAb的内源荧光强度随着金溶胶浓度的增加而有规律性地降低,但发射峰位及峰形不变(图3),说明纳米金溶胶对McAb荧光有猝灭作用.由图4可见,随着温度的升高,McAb猝灭曲线的斜率降低,由此可初步判断该过程不是动态猝灭(动态猝灭依赖于扩散速率,因而增高温度导致扩散加快,猝灭常数随温度的升高而增大),而是静态猝灭.若Ksv为动态猝灭常数,由于生物大分子的荧光寿命t0=10-8s,而各类猝灭剂对生物大分子扩散碰撞猝灭常数Kq的最大值为2×1010L/(mol·s).由图4曲线的斜率可得15和25℃的猝灭常数Ksv分别为39.74×103L/mol和22.60×103L/mol,所以Kq分别为39.74×1011和22.60×1011,远大于Kq的最大值,这进一步证实猝灭过程为静态猝灭.在静态猝灭作用中,静态猝灭荧光强度与猝灭剂的关系可由荧光体-猝灭剂分子间的结合常数表达式推导求出.以lg(F0-F/F)对lgc0作图;由所得直线斜率可知抗体蛋白McAb上的金颗粒结合位点数n与结合常数KA.线性回归方程为y[lg(F0-F)/F]=0.8928x(lgc0)+3.8457,R2=0.999,所以,抗体蛋白上的金颗粒结合位点数为0.8928,结合常数KA为7.009×103.表明纳米金溶胶与McAb有较强的结合作用.将金溶胶溶液的吸收光谱与McAb的发射光谱比较,两者间有重叠部分(见图5),说明McAb与金溶胶颗粒之间发生了荧光能量转移.由于金纳米颗粒并未使McAb发射光谱的峰形发生改变,所以,应该不是辐射能量转移.根据Förster偶极-偶极无辐射能量转移理论,当两种化合物分子满足以下条件时,将发生非辐射能量转移:(1)供能体发射荧光;(2)供能体的荧光发射与受能体的吸收光谱有足够的重叠;(3)供能体与受能体足够接近,最大距离不超过7nm.根据上述分析,可以认为McAb内的色氨酸残基与纳米金溶胶之间发生了能量转移作用,从而使McAb荧光被猝灭.2.5mcab与金纳米粒子作用的构象变化蛋白质的同步荧光光谱可被用来初步判断蛋白质的构象变化.相同条件下McAb和McAb与金颗粒复合物的同步荧光光谱见图6.298nm处的吸收峰归属于色氨酸残基,340nm处的吸收峰归属于酪氨酸残基.与未加入金颗粒的McAb相比,酪氨酸残基和色氨酸残基的荧光强度显著降低,而最大发射波长没有发生明显的位移,说明二者反应后McAb所处环境的极性未发生明显改变.圆二色谱(CD)能定量分析McAb与金粒子作用过程中McAb的构象变化.由图7可见,McAb在195nm处表现为正吸收峰,在208和220nm处表现为负吸收峰,是高α-螺旋结构蛋白质的CD特征光谱.与金纳米粒子作用后,McAb在195nm处的正吸收峰升高,而在208和220nm处的吸收负峰略降低.表明与金溶胶作用后McAb的结构发生了微弱的变化.通过CD光谱进行定量分析,McAb的构象组成为α-螺旋,含量从52.5%升高到54.2%,β-折叠的含量从21.0%降到19.8%,转角含量从4.6%升高到7.3%,无规则卷曲20.2%略增为20.5%.表明McAb与金纳米粒子作用后结构略加紧密.2.6荧光符合表征通过上述光谱分析可以对金溶胶与McAb之间的相互作用作以下描述:纳米金对McAb具有荧光猝灭作用,猝灭类型为静态猝灭,猝灭的速率常数随着温度升高而降低.金溶胶溶液的吸收光谱与McAb的发射光谱分析结果表明,McAb与金溶胶颗粒之间发生了荧光能量转移.同步荧光光谱显示,二者反应后McAb所处环