寒地月亮愈伤组织诱导及植株再生的研究

寒地月亮愈伤组织诱导及植株再生的研究

寒冷季节是黑龙江省罕见的冬季品种，具有很高的商业价值和广阔的应用前景。建立高效的植株再生体系是对其进行遗传性状改良的基础。目前,国外以月季叶片、茎段、根和花丝等为外植体,通过直接或间接的器官发生途径及体细胞胚发生途径再生植株已获得成功(NoriegaandSondahl,1991;Areneetal.,1993;HsiaandKorban,1996;Dohmetal.,2001)。国内的研究则主要集中在以茎尖或带芽茎节为外植体进行离体快繁(李青等,1999;李海燕等,2004),对愈伤组织诱导和植株再生研究成功的报道相对较少,并且因受基因型的限制,再生率普遍较低(任桂芳等,2004;高丽萍等,2005)。本研究选取5个寒地月季品种为实验材料,通过愈伤组织诱导再生植株,以期建立高效的再生体系,为进一步开展寒地月季育种研究与应用奠定基础。1品种acq.抗寒月季(RosachinensisJacq.)品种2004-5、2004-6、2004-7、2004-8和2004-9的无菌苗由东北农业大学寒地园林植物实验室培育。2一般组成和培训条件2.1培养基产品2.1.1愈伤组织的诱导分别以5个月季品种无菌苗的小叶和茎段为外植体,将小叶切割成0.5cm×0.5cm左右的小块,茎段切割成长2–3cm的小段,接种到愈伤组织诱导培养基中。基本培养基为MS,添加不同的生长调节剂(表1),附加3%的蔗糖和0.7%的琼脂,pH值调至5.8。2.1.2受伤组织的继代训练将愈伤组织接种在相同的新培养基中,待其生长到一定量后,观察愈伤组织的结构和形态。2.1.3正离子束培养基的设计将能够在继代培养基上正常生长的愈伤组织切成1cm×1cm左右的小块,接种到愈伤组织分化培养基中。基本培养基为MS和1/2MS,分化培养基的激素组成采用4因素3水平的正交实验设计方案(表2),并对每个组合进行3次重复实验,附加3%的蔗糖和0.7%的琼脂,pH值调至5.8。每次实验均接种100块愈伤组织,培养30天后观察愈伤组织的分化情况并统计其分化率。2.1.4再生植株的生根和移植将再生幼苗接种到附加不同浓度NAA(0.05、0.1和0.2mg·L–1)的1/2MS培养基上进行壮苗生根。2.2诱导愈伤组织的诱导率愈伤组织在黑暗条件下培养7天后进行光照培养,光照强度为50μmol·m–2·s–1,光周期为16小时/8小时,培养温度(25±2)°C。每次实验均采用100个外植体,并对每个组合进行3次重复实验。培养30天后统计愈伤组织的诱导率。愈伤组织分化的培养条件分别为黑暗和光照,光照培养条件和培养温度同愈伤组织诱导。3结果与讨论3.1培养基的选择愈伤组织诱导的结果见表3。从表3可以看出,5个寒地月季品种在附加不同生长调节剂的培养基中均可诱导出愈伤组织,但愈伤组织的诱导率与基因型紧密相关,不同品种间的诱导率差异很大。此外,不同外植体诱导愈伤组织的能力也存在很大差异,在以附加生长素类物质为主的培养基中,叶片诱导愈伤组织的能力大于茎段。附加生长素NAA或2,4-D的培养基均能够诱导出愈伤组织,但无论从诱导率还是从所诱导愈伤组织的质量上看,附加2,4-D的培养基诱导愈伤组织的效果要优于附加NAA的培养基,由附加NAA的培养基诱导出的愈伤组织在继代过程中会严重褐化,不适合进行下一步实验(图1A,B)。生长素与细胞分裂素配合使用,当细胞分裂素浓度较低时,有时会形成质量较高的愈伤组织,适合进行下一步培养;但当细胞分裂素浓度较高时,愈伤组织诱导率和生长量均明显下降,且其结构非常致密(图1C),说明高浓度的细胞分裂素不适合用于月季叶片和茎段愈伤组织的诱导。根据愈伤组织的诱导率及其继代培养的能力,确定5种寒地月季品种愈伤组织诱导的最适培养基。适合2004-5、2004-6和2004-8叶片诱导愈伤组织的培养基为MS+3.0mg·L–12,4-D;适合2004-7和2004-9叶片诱导愈伤组织的培养基为MS+2.0mg·L–12,4-D;适合2004-5和2004-7茎段诱导愈伤组织的培养基为MS+3.0mg·L–12,4-D;适合2004-6、2004-8和2004-9茎段诱导愈伤组织的培养基为MS+2.0mg·L–12,4-D+0.5mg·L–16-BA。3.2在分化培养基中的观察表4显示了各月季品种愈伤组织的分化情况。从表4可以看出,2004-5茎段愈伤组织及2004-7的叶片和茎段愈伤组织在分化培养基中均可诱导出胚性愈伤组织,但胚性愈伤组织在进一步培养中未形成再生植株(图1D);2004-8在分化培养基中能够诱导出不定芽和胚状体,2004-9在分化培养基中能够诱导出不定芽和胚性愈伤组织(图1E–H),不定芽和胚状体在继代培养中逐渐形成再生植株(图1I);2004-6的愈伤组织在分化培养基中未发生分化,在继代培养过程中不断褐化死亡(图1J)。本研究发现,较高浓度的TDZ与不同浓度的2,4-D、6-BA和GA3组合的愈伤组织分化培养基可使4个月季品种的愈伤组织发生分化,其中2004-8与2004-9还获得了再生植株,说明TDZ在月季愈伤组织分化培养过程中具有重要作用。实验过程中还发现,单独使用TDZ时,仅有2004-8茎段愈伤组织发生分化,其它的分化尚需要几种激素的组合使用,但激素的种类和浓度与基因型和外植体紧密相关,不同的基因型和外植体其愈伤组织分化培养基存在明显差异(表4)。黑暗条件下,各月季品种的愈伤组织均未发生分化。愈伤组织均是在光照条件下发生分化。黑暗条件下,愈伤组织在分化培养基中可以继续生长,但颜色呈白色或灰白色,分化能力差或不具分化能力(图1K)。光照条件下,愈伤组织呈绿色或者黄绿色(图1L,M),这种形态的愈伤组织大多具胚性,在进一步培养过程中可诱导出胚状体或不定芽。对各月季品种未分化的愈伤组织进行继代培养,随着继代次数的增加,愈伤组织的分化能力逐渐下降,愈伤组织的颜色和形态也不断恶化。其中,2004-9的部分愈伤组织退化并呈淡红色,且结构变得疏松;2004-8的部分愈伤组织在继代过程中产生水滴状的透明分泌物,且愈伤组织的结构变得致密(图1N,O)。当继代次数超过5次后,多数愈伤组织基本丧失分化能力,且大量褐化死亡。3.3最适生根培养基的确定2个月季品种2004-8和2004-9再生苗(图1P)的最适生根培养基为:1/2MS+0.05mg·L–1NAA(图1Q),生根率均在80%以上;且无菌苗通过驯化炼苗(图1R),露地移栽后成活率均高于88%。3.4种生长素类物质对共同诱导的期内循环说的影响本研究结果表明,不同基因型、外植体类型及培养基之间的交互作用对月季愈伤组织的形成和分化均具显著影响,这与Kintzios等(1999)、Li等(2002)和任桂芳等(2004)已报道的研究结果相似。在愈伤组织诱导过程中,单独使用生长素类物质或与细胞分裂素组合使用均可以诱导出愈伤组织,但较高浓度的细胞分裂素阻碍愈伤组织的诱导。本实验比较了2种生长素类物质(2,4-D和NAA)对月季愈伤组织诱导的影响结果发现2,4-D的效果远远优于NAA,这与Kintzios等(1999)的研究结果不同,但与Li等(2002)的研究结果一致,这可能与实验材料的基因型不同有关。在月季植株再生研究中,Rout等(1991)、Kintzios等(2000)和Li等(2002)利用6-BA、TDZ、NAA和2,4-D等植物生长调节剂配比和不同培养条件的组合,通过愈伤组织发生、体细胞胚胎发生和器官直接发生等途径获得了再生芽。本研究利用TDZ、2,4-D、6-BA和GA3四种植物生长调节剂,诱导5个寒地月季品种愈伤组织分化,结果有2个月季品种的愈伤组织发生分化并成功获得再生植株。研究中发现TD