植物组织培养中外植体褐变的影响因素

植物组织培养中外植体褐变的影响因素

在过去30年中，该组培技术主要应用于花卉生产、作物栽培和特殊经济植物的幼苗和脱毒苗，使作物的栽培逐渐集中、规模、自动化，并受到自然的影响。尽管组织培养方面理论研究比较成熟,但在试验和生产过程中常常会遇到外植体褐变、污染和玻璃化现象这三大难题,而褐化能否得到有效控制是植物组织培养能否成功的关键所在。褐化现象主要发生在外植体、植物愈伤组织的继代培养、悬浮细胞培养、花药培养以及原生质体的分离与培养中。褐化产物不仅使外植体、细胞、培养基褐变,而且抑制外植体正常的生理生化反应,影响外植体的生长与分化,甚至导致其死亡。所以,如何防止或减少褐变显得尤为重要。笔者总结最新褐变发生途径、产生机理,以期为植物组培技术的进一步完善提供理论依据。1黄褐色改变的发生1.1外植体的选择与棕榈树的发生有关1.1.1不同品种葡萄品种褐变的原因植物的基因型对外植体褐变发生频率、程度都存在根本性影响,轻者影响细胞生长和繁殖,重者导致细胞死亡。这是由于基因会从根本上导致植物体内相关物质合成量有差异。在木本植物中,单宁含量或色素含量高的植物容易发生褐变,这是由于酚类的糖苷化合物是木质素、单宁或色素的合成前体,酚类化合物含量高,木质素单宁或色素形成就多,而酚类化合物含量高将导致褐变的发生,因此,木本植物一般比草本植物更容易发生褐变。在植物组织培养中,不同物种之间褐化程度差异很大,就是同种植物的不同品种间也存在一定差异,在比较两类葡萄品种的褐变时,发现酚类物质含量与褐变发生具有正相关性。同一种植物中,幼龄材料一般比成龄材料褐变轻。马文卿等证实,大花蕙兰是易褐化的植物,由基因型导致外植体诱导和试管苗增殖中均存在褐化现象。1.1.2外植体的生理生化指标外植体取材的不同状态具体表现为外植体生理状态、取材部位、取材时期、外植体的大小及受伤程度、外植体预处理等。幼龄材料比成龄材料褐变轻,这可以用幼龄材料的酚类化合物含量少,而成龄材料多来解释。平吉成在研究小金海棠、八楞海棠和山定子刚生成的实生苗上切取茎尖进行组培的试验中,发现接种后褐变很轻。高度分化的叶片作为外植体,接种后则很容易褐变,而在幼嫩器官或组织(如胚)中,褐变则较轻。植物体内酚类化合物含量、PPO(多酚氧化酶)活性与外植体所处的生长季节有关,而PPO活性和酶类含量有正相关性,春秋季较弱,随着生长季节的到来,酶活性逐渐增强,所以早春和秋季取材较为适宜。Wang等也报道“富士”苹果和“金华”桃5~8月取材褐变严重,而在9月到翌年2月取材褐变有所减轻,核桃的夏季材料比其他季节材料更易褐变。外植体大小对褐化的影响,表现为小的材料更易发生褐化,相对较大的材料褐化的程度则较轻。由于膜结构或细胞中物质区域化分布的破坏是酚类物质酶促褐变的重要因素,切口越大导致酚类物质的被氧化面也越大,褐化程度会更严重。Bonga等在巨桉和卡德兰的组织培养中得出,外植体越小,切面与体积的比率越大,伤害及褐化的程度越大。除了机械伤害外,接种时各种化学消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变。组培中常用酒精和升汞消毒。Ziv等用0.3%升汞代替Ca(ClO)2进行消毒,可降低鹤望兰的褐变程度。一般来说,延长外植体消毒时间会使消毒效果增加,但对外植体伤害也大,从而加剧褐变。因而消毒时间应掌握在一定范围内,才能保证较高的外植体存活率。1.2外植体的生长条件与棕榈树的发生有关1.2.1环境条件1.2.1.光照强度对泡菜化的影响在自然光照条件下,生长的植物体内酶活性较高,外植体易褐变,当把母株放置在黑暗或弱光条件下生长,植株组织内光诱导的那些参与酚类合成与氧化的酶活性就大大减弱,酚类化合物的合成减少,其氧化产物酮类也相应减少,使褐变得到控制。吴永英等发现随着光照强度的增大,甜菜的褐变率明显上升。苹果、桃、葡萄、金缕梅和丝穗木等植物的茎尖外植体,如果取自田间自然光照下的植株枝条,接种后很容易褐变,而事先对取材母株或枝条进行遮光处理,之后再切取外植体,则可有效控制褐变。1.2.1.低温对褐变的抑制作用温度对组织褐变影响比较大,从酶促反应的角度,其根本原因是植物体内酶活性和温度直接相关。低温不仅会降低相关酶(如PPO)的活性,从而抑制褐变,还可以抑制酚类化合物的合成,减少底物酚类氧化,进而减轻褐变。罗丽华等发现温度不同,酶的活性也不同,温度较低的情况下褐变明显减轻,19℃下较适宜板栗愈伤组织的培养。王明华等在褐变很严重的“芭蕾”苹果上验证了低温对褐变的抑制作用。Ishii等研究发现卡特兰在15~25℃时褐变程度比25℃以上轻。过高的温度,不仅影响酶促反应的进行,也会导致培养基内非酶促反应的发生,再加上外植体本身需要在一定温度条件下生长,会使褐化现象更为严重。1.2.2培养基1.2.2.培养基及试剂用量液体培和半固体培养系统中,外植体溢出的有毒次级代谢产物可以得到充分的扩散,降低其浓度,因而对外植体造成的危害较轻,如果再加上滤纸做成纸桥,褐变抑制程度有所提高,这可能是滤纸吸附了少量有害的酚类物质。培养基中的琼脂含量降低,外植体褐变严重,培养基中水分含量相对增加,外植体褐变产生的鞣质具有一定的极性,更加易于溶出,毒害细胞,加重外植体的褐变。所以,为降低褐化程度,应该在允许的条件下,适当增加培养基的硬度,琼脂用量大,培养基硬度大,则褐变率低;随着琼脂用量的减少,培养基浓度减少,组织褐变加重。1.2.2.培养基及添加量对核桃基质元素的影响在初代培养时,培养基中无机盐浓度过高会引起酚类物质外溢,加剧褐变。降低盐的浓度,尤其是降低Mn2+和Cu2+等可作为氧化酶类的组成成分或辅因子离子的浓度,能够降低酶活性、抑制酚类氧化、减轻褐变。刘兰英等证实将DKW培养基的无机盐浓度减少1/2,核桃外植体的褐变率就由55.8%降至32.5%。赵鹂等认为较低浓度的无机盐含量,有利于防止植物材料褐化;而钟士传等则认为,较高浓度的无机盐含量有利于防止褐化,所以无机盐含量的变化与褐化率未呈现比例关系。马文卿等也证实,基本培养基为MS时褐化率最低,其次为1/4MS,1/2MS时褐化率达到最高。所以盐浓度的高低与褐变没有明显正相关性,可能与其他影响因素相互制约,而在不同外植体中制约更加明显,从而表现出盐浓度高低与褐变程度的相关性。1.2.2.外植体的生长不同植物分裂素和生长素能影响外植体发育和褐变酶活性,细胞分裂素BA或KIN具有使得PPO活性提高的作用。在柿树的组培中,用改良的MS培养基(ZT9.13μmol/L,IAA0.57μmol/L)能促进外植体的生长与分化,减轻外植体的褐变程度。BAP(6-苄氨基腺嘌吟)或KT(激动素)能促进酚类化合物的合成,其浓度大小会影响多酚氧化酶的活性,而生长素类激素,如2,4-D可延缓多酚合成,减轻褐变发生。1.2.2.营养方面的影响培养基低pH值可降低多酚氧化酶的活性和底物利用率,抑制褐变。同时pH值影响细胞膜的渗透性,以及相应酶的活性,从而影响褐变。一般来说,较为酸性的环境可以减少褐变。在进行大白菜叶肉原生质体的培养中发现,褐变程度高的培养基,其pH值下降到5.0时,若提高外加新鲜培养基的pH值至6.5,可明显抑制褐变。在水稻体细胞培养中,pH值为4.5~5.0时,MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态,而pH值为5.5~6.0时,愈伤组织严重褐变。1.2.2.外植体培养基为减轻褐化程度,可向培养基内加入一些化学添加剂。一般有吸附剂、抗氧化剂、螯合剂和激活剂四大类。常用的吸附剂有AC(活性炭)和PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂,能吸附培养基中的有害物质,减轻褐变。粉末状与颗粒状AC相比,吸附性更强,一般在培养基中加入2~3g/L的AC。张红针对库拉索芦荟组培中的褐变现象,在培养基中加入活性炭500.0mg/L,环境温度控制在25℃,有利于减轻褐变。考虑到AC也吸附培养基中的生长调节物质,对外植体的生长带来竞争性抑制,应结合具体情况改变培养基的物质配比。Zaid认为,在加有AC的培养基中,生长调节剂的浓度应适当提高。最近,试验证明了PVP没有普遍防止褐变的效果,原因是植物体内存在着不同的酚类物质,而PVP也存在不同分子量的类型,这是由于PVP在吸附酚类物质时,具有较高专一性。在大花蕙兰试管苗增殖过程中的褐化研究中,选取AC和PVP2种抗氧化剂:Vc和硫代硫酸钠,结果表明,添加1500mg/L的AC效果最好,能够使得试管苗生长旺盛,保持较高的增殖系数。抗氧化剂可改变外植体周围的氧化还原电势,从而抑制酚类氧化、减轻褐变,例如Vc(抗坏血酸)、Na2S2O3(偏二亚硫酸钠)、柠檬酸、二硫苏糖醇等。Vc为多羟基还原物质,在酶的催化下能消耗溶解氧,使酚类物质因缺氧而无法氧化,Vc也会影响多酚氧化酶的活性,从而阻止酚类物质氧化。在辣椒中加入Vc可明显减轻褐变程度,梅兴国等发现,在培养基中添加100mg/L柠檬酸可显著抑制红豆杉细胞褐变,且生长速率也高,Vc和半胱氨酸有一定的抗褐效果,但比二硫苏糖醇和柠檬酸差,Na2S2O3的抗褐效果最差。金属螯合剂(EDTA)中的Cu2+从酶中螯合出来,形成稳定的螯合物,使多酚氧化酶失去活性。这是由于多酚氧化酶是一种含铜的蛋白质,其氧化活性依赖于铜的氧化还原作用。有报道指出,PPO在植物体内以潜伏态存在,其活性可以被SDS(十二烷基硫酸钠)或蛋白酶激活。Cabanes等发现,SDS可以激活梨PPO活性。陈冬茵等发现SDS也能激活蝴蝶兰PPO活性,其原因可能是酶蛋白与SDS结合使构型发生变化,导致活性增加。在试验操作中,可以结合这些化学添加剂的生理生化特性,在适当培养条件使用同一外植体培养基中,发挥抑制协同作用进而大大减轻褐化的程度。如杨薇红等在亚洲百合接种前用50mg/LVc浸泡外植体2h,并在之后的继代培养中加入150mg/LPVP,以抑制组培苗褐变现象的发生。1.3漂浮培养法外植体的接种方式与褐变发生有一定相关性,这可能与外植体的极性相关。用薯蓣的茎段做外植体进行组培时,将茎段正向插入培养基中,褐变现象明显,而将茎段倒向插入时,则褐变消失。用漂浮培养法可有效防止决明原生质体沉淀、改善通气状况、使营养分布均匀、抑制酚类物质释放、减轻褐变、提高原生质体分裂率。接种后放置的时间越长,易褐变的材料伤口周围会积累更多醌类物质。所以,在外植体接种后1d之内,转移至新鲜培养基中或同一培养基的不同部位,然后,7d内,1次/d转瓶,提高转瓶频率,褐变得到有效控制。山杏原生质体培养在0.5×105ml-1的植板分裂频率和植板率中最高,随着植板密度的增大,褐变逐渐加重,而分裂频率和植板率下降。2非酶促褐变的作用关于褐变产生机理理论,目前研究较为透彻。褐变分为2类,即酶促褐变和非酶促褐变。非酶促褐变是由于细胞受胁迫条件或其他不利条件影响(如高温)所造成的细胞死亡或自然发生的细胞死亡而导致的褐变,其中未涉及到酚类物质的产生。酶促褐变是在相关酶系统的作用下导致的外植体褐变,在组培中,酶促褐变为主导因素,但非酶促褐变也不能忽略。2.1储藏温度对香蕉汁色速率的影响目前,最新研究非酶褐变的一般方法是建立产品褐变速率常数的动力学模型,并认为非酶褐变随时间呈线性增加(零级动力学)或以指数增加(一级动力学)。王素雅等研究得出香蕉汁低温(4℃)储藏褐变速率常数为0.0002A420/d,随着储藏温度升高,香蕉汁色泽变化加剧,40℃时褐变速率常数达0.0127A420/d,比4℃储藏的果汁高60多倍。由于香蕉汁加工过程中,经历了热烫与高温杀菌,多酚氧化酶催化的酶促褐变在果汁储藏期间不会出现。说明储藏温度是影响香蕉汁非酶促褐变速率的重要因素,酚类化合物的非酶褐变反应机理尚不清楚,可能是酚类化合物先氧化成醌,然后再与其他酚类物质聚合而形成橙色高分子聚合物。温度改变相关褐变酶的活性进而影响褐变程度的过程中是否有非酶促因素的影响,其可能性与机理仍需进一步研究。2.2生理指标及pod的变化酶促褐变是因为酚类物质的参与而引起的褐变现象,外植体酶促褐变研究相当广泛和深入。酶、底物和氧是酶促褐变的必要条件。引起褐变的酶主要是PPO、过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PLA)等。一般认为,酚类物质是外植体酶促褐变反应中的底物,其含量与外植体褐变密切相关,PPO是催化褐变反应的关键酶,是一种含铜酶,其活性依赖于铜的氧化还原作用。该酶适宜反应体系的pH值范围为5.8~6.8,40℃以下活性稳定,45℃以上活性迅速下降。引起褐变的酶底物主要是酚类化合物,它是植物界中种类最多、分布最广的次生代谢物质之一。酚类物质是一类有害的次生代谢产物,在植物细胞中能与蛋白质或酶发生氢键缔合,与许多金属离子络合,其氧化产物醌在植物细胞内既能自我聚合,也能与含有羟基(-OH)、氨基(-NH2)和巯基(-SO3H)之类的化合物发生反应而产生有色物质,导致褐变。POD是植物防御中的第一道防线,有报道说,POD和PPO共同氧化酚成醌,醌转变成缩合型鞣质,最后形成褐色的聚合体,总酚含量低的外植体褐变程度低。许传俊试验表明,在褐变发生过程中,酚类物质逐渐增加,与合成酶活性呈现显著的正相关,从而导致褐变的发生。抑制酚类的合成和PAL活性,褐变发生也会被抑制。在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变,这是因为在正常的组织细胞内,多酚类物质分布在细胞的液胞内,而PPO则分布在各种质体或细胞质内,这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时,则为酶创造了与PPO接触的条件,在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌,进行一系列的脱水、聚合反应,形成黑褐色物质,从而引起