菊花对农杆菌的敏感性及其改良研究

菊花对农杆菌的敏感性及其改良研究

通过传统的混合育种方法，菊花的品种改良在植物形状、花色、开花期、病虫害和非生物胁迫方面取得了显著成效。但菊花高度杂合的特点使其在杂交育种中不确定性很强,生殖或地理隔离使其无法充分利用近缘种属植物的优良基因资源,常规方法育种存在较大的局限性。转基因育种目前已成为菊花新品种培育的重要手段,外源基因的导入有针对性地改善了目标性状并保留原有优良性状,实现了利用新基因资源改良菊花品种的目标。农杆菌介导的外源基因转化是最为常用的菊花转基因的手段,其转化效率依赖于基因型和外植体的再生特性。1989年Lemieux利用农杆菌介导法成功获得第一株转基因菊花(Lemieuxetal.,1990),开创了菊花分子育种的新途径。至今分子育种已在花色、花期、抗性等方面取得了极大成就。1外源基因表达提高自20世纪70年代中期首次发现菊花对农杆菌敏感以来,农杆菌介导法已成为菊花遗传转化中最常用的方法,但存在转化效率低、外源基因表达量低、嵌合体株率高及再生过程中基因沉默等问题。外植体的选择、抗生素的确定、易感菌株的选用、共培养条件等对转化效率起着决定性作用。1.1利用比较显著的菊花遗传转化效率菊花对LBA4404、EHA105、EHA101、AGL0和Ach5等多种农杆菌菌株都表现出敏感性(Ledgeretal.,1991;Renouetal.,1993;deJongetal.,1994)。Ledger等(1991)首次使用农杆菌LBA4404转化菊花品种‘Korean’,成功获得转基因菊花,遗传转化率达到1.7%。Renou等(1993)利用EHA101菌株转化菊花,遗传效率可达到5%~40%。Shinoyama等利用LBA4404和EHA101菌株转化菊花品种‘ShuhoNoChikara’,并对两者遗传效率进行比较,LBA4404为5.2%(Shinoyamaetal.,2002b),EHA101为4.4%(Shinoyamaetal.,2002a)和8.8%(Shinoyamaetal.,2003);利用EHA101和EHA105两个菌株转化菊花栽培种‘YamateShiro’,得到了相对较高的遗传转化效率,EHA101为21.7%(Shinoyamaetal.,2002a)和22.0%(Shinoyamaetal.,2008),EHA105为23.9%(Shinoyamaetal.,2012b)。此外,Ach5、AGL0、B6S3等菌株也应用于菊花的转化过程,并成功获得较高的转化效率(Pavingerováetal.,1994;Urbanetal.,1994;Annadanaetal.,2002)。在早期的菊花遗传转化中,对菌株的选择较分散,其中LBA4404的使用率较高,其次为A2002、A281、Ach5等菌株。deJong等(1994)和Urban等(1994)发现使用的菌株不同,转化的效率不同,AGL0和EHA105相较LBA4404的遗传转化效率更高。近些年,随着菊花转化方法的不断改进,遗传转化率高的菌株的使用表现出集中化,主要为LBA4404,其次为EHA101和EHA105,再次是AGL0。综合菊花转基因的成功案例中不同菌株的使用情况(Teixeiraetal.,2013),最为常用的LBA4404菌株遗传转化率高且较稳定,使用的比例占32.0%,其次为EHA105、AGL0和C58,分别占15.5%、11.7%和7.8%。1.2外植体与农杆菌共培养外植体的来源和生理活性也是决定转化效率的另一主要因素。迄今为止,叶片是最为常见且效率较高的农杆菌侵染受体,其次是茎(Teixeiraetal.,2013);此外,采用花梗(Lemieuxetal.,1990;deJongetal.,1995;Annadanaetal.,2002)、花瓣(deJongetal.,1994)和根(Dolgovetal.,1997)作为受体的遗传转化均获得成功。外植体与农杆菌共培养过程中,添加乙酰丁香酮或水解酪蛋白等辅助试剂的培养基可以促进提高农杆菌的侵染效率。在共培养基质中添加100μmol·L-1的乙酰丁香酮可以提高农杆菌的侵染性(deJongetal.,1994)。Shinoyama等(1998)发现50μmol·L-1的乙酰丁香酮就足以提高农杆菌的侵染效率,同时还发现添加水解酪蛋白的共培养基可显著提高侵染效率,及添加5%(体积比)聚山梨酸酯后可以增强农杆菌与外植体之间的粘合性。1.3自我抑制剂的选择菊花转化中选择标记基因的使用最早见于1990年(Lemieuxetal.,1990),该基因为新霉素磷酸转移酶II基因(nptⅡ),卡那霉素在之后的研究中被作为最主要的抗生素。此外,潮霉素、巴龙霉素、遗传霉素等抗生素均在选择转基因菊花阳性植株中取得了成功,并得到了广泛的应用(Shinoyamaetal.,2002a;Aidaetal.,2004;Narumietal.,2005b;Kuboetal.,2006)。此外,Xie等(2012)以磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)为选择性标记基因,用甘露糖作为选择剂,以PtDHAR作为目的基因,获得了转化植株。通过甘露糖筛选后,155株幼嫩植株存活,通过Southernblot分析,4个株系转入了目的基因,这种甘露糖选择标记系统,对阳性植株的选择非常有效,可以代替抗生素作为安全性非抗生素的阳性植株筛选剂。2改变菊花的优良特性2.1wjbachii基因在地被小菊中的应用转基因技术在观赏性状改良方面主要应用于花色、花形和株形等方面(表1)。查尔酮合成酶(chalconesynthase,CHS)是花青素合成的关键酶,跟花朵成色密切相关,将CHS的正义和反义片段导入菊花,抑制内源CHS的表达,植株花瓣颜色从粉色变成为浅粉色(Courtney-Guttersonetal.,1993,1994)。通过RNAi技术沉默类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoidcleavagedioxygenase,CCD)基因,花色由白色变为黄色,培育出优良的‘YellowJinba’新品种(图1,A、B)(Ohmiyaetal.,2006,2009)。F3′,5′H是花色素苷代谢途径中的一个关键性酶,控制合成飞燕草素,形成蓝色系花。Kim等(1998)将F3′,5′H基因成功导入野菊(Dendranthemaindicum)和紫花野菊(Dendranthemazawadskii)中,以期培育出蓝色菊花品种。抑制菊花隐花基因CAG(chrysanthemum-AGAMOUS),雄蕊和雌蕊表现出花冠状组织(Aidaetal.,2008),改变了花形。外源rol基因在菊花中表达,形成了矮小紧凑株型的植株(Mitiouchkina&Dolgov,2000;Kuboetal.,2006)。赤霉素不敏感gai基因的导入也可以获得矮小的植株类型(图1,D)(Pettyetal.,2003);此外,烟草光敏色素基因phyB1转入菊花可以引起植株轻微矮化(Zhengetal.,2001),甘薯MADS-box基因IbMADS4的转入也能获得矮小紧凑的株型(Aswathetal.,2004)。Khodakovskaya等(2009)发现异戊烯基转移酶基因IPT的导入可增强植株的侧枝发生,而分枝抑制子类似基因Ls-like基因的导入则会引起植株分枝的减少(Hanetal.,2007;Jiangetal.,2010),如图1,C所示(Jiangetal.,2010)。这些性状的改变为园林绿化的地被小菊提供了矮化多分枝的新种质。Narumi等(2011)利用CRES-T(嵌合抑制子沉默技术)将拟南芥生长发育相关基因TCP3与植物特异转录抑制域SRDX相融合,而后转入菊花,获得了具有指状细长形叶片的植株。2.2外源ft基因改变菊花发育菊花是典型的短日照植物,在短日照的秋季开花,之后随温度下降进入休眠状态,开花受光周期和温度共同影响。转基因技术越来越多地运用于调节菊花开放时间(表2)。与开花时间相关的基因有CO,FT,COL,HY5和COP1等,其中FT蛋白具有诱导花芽分化的作用,如将拟南芥FT(FLOWERINGLOCUST)基因转入‘神马’菊花中,转基因株系的组培苗在16h光照下分化出花蕾,说明外源FT基因使短日照菊花具有了不依赖光周期控制而开花的特性,通过转FT基因来改变菊花的花期是可行的(图1,E)(姜丹等,2010)。Oda等(2012)从甘野菊中分离出FT类似基因CsFTL1、CsFTL2和CsFTL3,其中CsFTL3被证实是光周期调控开花的关键调节子,CsFTL3在菊花中过表达后,与对照相比,在非诱导光照下可正常开花,推断CsFTL3可能诱导菊花提早开花。在菊花品种‘Sei-Marine’中导入突变的乙烯受体基因mDGERS1(etr1-4),降低了转基因植株对乙烯敏感性,使得转基因植株在低温条件下仍能正常开放(Narumietal.,2005a;Satohetal.,2008)。Morita等(2012)也验证了etr1-4突变体转基因菊花植株可以早花并对FLOWERINGLOCUST-like的表达量有明显提高。对于一些品种,外源GA的施加可以代替短日处理促进花形成,而乙烯或乙烯利将抑制花朵的开放(Sumitomoetal.,2008),证实了乙烯在花朵开放过程中起负调控的作用。2.3抗真菌和细菌设施栽培环境下种植的菊花极易感染病害,表现为植株矮化枯萎、叶片斑化、黑茎、植株生长抑制等,严重影响了菊花的经济价值。菊花的病害主要分为两类:(1)病毒和类病毒,菊花抗病毒转基因育种主要是将抑制病毒或类病毒发生的病毒本身基因的部分片段导入菊花后筛选抗病植株(表3)。如将黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白CP基因转入菊花‘Kundan’中,转基因植株对CMV的敏感性降低,同时延迟了植株的发病时间,表现出对CMV的抗性(Kumaretal.,2012)。该手段在菊花中还应用于TSWV,INSV,GRSV,CVB等病毒的抗性研究中(Urbanetal.,1994;Shermanetal.,1998;Yepesetal.,1999;Skachkivaetal.,2006)。(2)真菌和细菌,抗真菌和细菌的转基因育种主要将病菌抑制物基因导入菊花植株。在菊花抗真菌病害转基因育种中,应用最为广泛的是几丁质酶基因(chitinasegene)。如Takatsu等(1999)获得的11个转小麦几丁质酶基因RCC2的转基因菊花株系对灰霉病表现出不同程度的抗性(图1,F)。咖啡因作为一种次级代谢产物,针对真菌病害也具有典型的化学防御作用。如Kim等(2011a,2011b)将3个N–甲基转移酶基因(CaXMT1,CaMXMT1,CaDXMT1)导入到菊花‘Jinba’品种中,其咖啡因水平与烟草相同,具有灰霉病抗性(图1,G),同时还具有抵抗食草动物、鳞翅类昆虫和蚜虫侵害的作用。目前菊花抗虫分子育种中最常见的一类基因是从微生物苏云金杆菌分离出来的苏云金杆菌(Bacillusthuringiens)杀虫晶体蛋白基因,简称Bt基因(表3)。将苏云金杆菌内毒素基因BtⅡ转入菊花‘WhiteHurricane’将从苏云金杆菌中分离的杀虫蛋白Cry1A(b)基因分别导入菊花‘Parliament’、‘Shuno-no-chikara’及‘Yamate-shiro’品种中,均得到抗虫性转化植株(vanWordragenetal.,1993;Shinoyamaetal.,2002a,2008)。2.4干旱、盐胁迫和冷害对正常患者抗冷性的影响与农作物抗逆相关的基因主要有:(1)编码渗透调节物质和胁迫下细胞保护物质的基因,如果聚糖蔗糖酶基因,甜菜碱醛脱氢酶基因,水通道蛋白基因等;(2)细胞膜上的离子转运基因,如Na+/H+逆向运转体基因;(3)逆境相关的调控基因,如DREB转录因子。在菊花上应用最广泛的是逆境相关的调控基因DREB。DREB家族基因是提高植物非生物胁迫抗性的有效基因之一,拟南芥DREB转基因植株在干旱、盐胁迫和冷害处理时均表现出逆境耐性的显著增强(表4)。Hong等(2006a,2006b,2009)将35S和rd29A启动子驱动的拟南芥AtDREB1A基因转入地被菊花‘FallColor’品种中,在干旱和高盐等逆境诱导条件下,AtDREB1A在35S启动子驱动的转基因植株中为组成型过表达,而在rd29A启动子驱动的转基因植株中为诱导型过量表达。在干旱和盐胁迫条件下,转基因植株相较正常植株表现出更强抗性,且rd29A︰AtDREB1A转基因植株比35S︰AtDREB1A转基因植株表现出更强的抗性。在2℃冷处理条件下,通过表型分析、电解质渗出率、SOD活性和脯氨酸含量分析发现,AtDREB1A转基因植株表现出更强的抗冷性,且rd29A启动子驱动的转AtDREB1A植株抗冷性更为显著。在45℃高温胁迫条件下,70%的35S︰AtDREB1A转基因植株存活,而野生型的植株存活率小于20%,显示出转化株具有较强的抗高温能力(图1,H)(Hongetal.,2009)。3功能验证和基因序列的解释近几年,对菊科植物自身基因功能的研究也取得了长足的进展。将从菊科植物分离出的基因导入拟南芥、烟草等模式植物中进行功能验证,研究这些基因的作用机理。目前该类研究主要集中在菊花非生物胁迫耐性和侧枝发生等相关基因的功能分析(表5)。4无药物选择的基因转基因农作物可同时具有高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱和抗除草剂等多重优点,但同时转基因植物对环境和人类都存在潜在的威胁,菊花是一种典型的自交不亲和、天然异交植物,存在着通过虫媒或风媒授粉与菊科其他植物进行天然杂交的可能性,即存在外源基因漂移的危险。如野生型的菊科植物接受了转某种抗虫基因的菊花品种的花粉,F1代的野生植株就很有可能具有抗虫性。这种异源基因在菊科内的基因漂流现象对环境生态还有植物体本身具有潜在威胁,从一定程度上限制了转基因菊花的实际应用。然而Shinoyama等(2012b)的研究使这种问题的解决成为了可能:使用中间载体pBIK102H69A将甜瓜中突变的乙烯受体基因Cm-ETR1/H69A导入菊花‘YamateShiro’品种中,在获得的335个转基因株系中,有15个株系的花粉粒明显减少,其中3个株系在20~35℃条件下完全观察不到花粉粒,且发现转基因株系也会导致雌蕊不育,表明Cm-ETR1/H69A基因的表达能显著影响转基因植株的雄蕊和雌蕊育性。DMC1基因涉及减数分裂的同源重组过程,沉默该基因将导致重组的紊乱。将携带DMC1基因片段和cry1Ab基因片段的中间载体转入菊花中,获得的682株再生植株中有149个株系表现出较强的鳞翅类抗性,其中7个在正常生长温度下表现雄蕊不育性(Shinoyamaetal.,2012a),这对控制基因漂移具有重要作用。除目标基因外,选择性标记基因对于环境和植株体本身也会存在潜在的危害,其合成的蛋白可能会通过根系进入土壤,对土壤的微生物系统造成影响。Xie等(2012)以磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)为选择性标记基因,以甘露糖作为选择试剂的选择标记系统可有效选择出阳性植株,这种无抗生素筛选的基因导入法将有益于提高转基因植物的安全性。Sun等(2009)构建的pCAMBIA1300载体具有两个相邻的T-DNA区,分别携带潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)和β–葡萄糖醛酸酶基因(uidA),转入菊花‘Beilinhuang’,获得兼有潮霉素抗性和GUS活性的T0代植株17株,而在继续筛选的T1代中,大约有15.7%的转基因植株不含有选择标记基因,说明无选择标记基因载体系统也可应用于阳性植株的筛选同时还可降低抗生素的危害性,这在菊花转基因育种中也具有很好的借鉴性。5育种技术在菊花性状改善中的前景5.1分子育种促进dna的同源转化与其他观赏植物相比,菊花的遗传转化和分子育种研究较为广泛和深入(图1),主要原因是菊花植株的再生对培养条件要求不高,对多种根癌农杆菌敏感,遗传转化受体广泛,已建立了多种基因型适宜的遗传转化体系等。菊科植物花期长和抗逆性强等优良性状,为栽培菊花的分子育种提供了丰富的基因资源。在菊花中不仅重要功能基因的同源转化能够有效改良的目标性状(Hanetal.,2007;Jiangetal.,2010;Chenetal.,2011;Odaetal.,2012),还可以将非同属同科植物的优良基因通过异源转入进行性状改良(张路等,2011;Chenetal.,2012),较大程度拓宽了菊花性状改良的空间。菊花转基因研究进展显示,转基因技术育种具有提高观赏价值、降低生产成本、提高切花品质、提高抗性等优势,因此,结合常规育种,利用有效安全转基因手段,创造更加丰富的菊花种质资源将具有较好的应用前景。5.2玫瑰花花色的改良尽管菊花转基因研究已经有了长足进展,但大量基因资源未被挖掘和利用。随着菊花遗传转化体系的日益成熟,需要越来越多的基因资源来满足转基因性状改良的需求,特别是菊科植物中特