菊花育种研究进展

菊花育种研究进展

0农艺性状的改良和利用技术研究菊花是菊花和菊花的多年生草本植物。它在世界广泛用于花卉、盆花和庭院绿化。迄今为止，国内外菊花育种者利用极其丰富的种质资源，通过常规杂交育种手段在株型、叶型、花型、花色等观赏性状改良方面取得了卓有成效的业绩。但是，低温、干旱和盐渍耐性等农艺性状改良方面进展相对缓慢。并且，由于菊花遗传背景十分复杂，基因型高度杂合，常规育种往往受到染色体的多倍性和非整倍性的影响，带来自交不亲和性、种子生产效率低等问题。此外，菊花常规育种存在着无法利用其它物种基因资源的局限性。随着对现代菊花栽培品种要求的不断提高，人们把目光转向了具有定向育种优势的基因工程育种，通过外源基因的人工导入，定向修饰菊花的某个或某些目标性状并保留原有的优异性状，从而获得具有目标性状的菊花新材料。菊花在观赏植物中是现代生物技术研究应用较早和较多的种类。1968年以茎段为外植体开发了菊花的组培技术，1989年发现了菊花对农杆菌浸染的敏感性，并因此在菊花上开发了遗传转化技术。近20年来，菊花研究工作者借鉴模式植物领域和农作物领域分子育种方面的研究成果，在特异花色、花型等观赏性状和病虫抗性、非生物逆境耐性等农艺性状基因工程种质改良方面，取得了长足的进展，有些成果具有较好的应用前景。1菊花再生体系与高效遗传转化体系的构建1.1茎段外植体有关菊花再生的研究文献可以追溯到1968年，最初是以茎段为外植体。此后，各国学者分别以菊花各器官或组织，如茎尖、小花、花梗、叶片、花瓣、子房、叶柄、花托等为外植体，相继建立了再生体系。1.1.1生长素和细胞分裂类物质关于菊花的离体培养条件，首先是基本培养基种类的选择，多数研究采用MS，也有少数采用B5。在此基础上，进行植物生长调节剂的优化组合筛选，其中生长素类和细胞分裂素类物质的筛选、浓度以及比例确定等是研究的核心内容（表1）。生长素和细胞分裂类物质的添加对菊花离体培养是必需的，并且这2种植物生长调节剂的浓度和比例也因菊花基因型的不同存在较大差异。如，以‘BirbalSahni’为试材，愈伤组织诱导嫩芽的最佳培养基组成为MS+0.1mg·L-1IAA+0.2mg·L-1BA；以‘FallColor’为试材，胚状体诱导成芽的最佳培养基组成为MS+1.0mg·L-1KT+0.1mg·L-1NAA+2mg·L-1GA3。此外，有研究维生素和矿物质对菊花外植体再生影响的报道。BA和IAA一起使用有利于菊花花梗愈伤组织形成不定芽，当缺乏维生素和矿物质时，或者大量元素和微量元素中没有KNO3和NH4NO3时，不定芽的形成受到抑制。1.1.2外植体大小及成熟程度对再生率的影响总的说来，菊花的营养和生殖器官或组织均具有不定芽再生的能力，如叶片、叶柄、茎段、花瓣、花梗等。在进行菊花遗传转化的研究中，用来作为受体的外植体多采用叶片、无芽茎段以及花梗。研究结果表明，菊花不同外植体的大小和成熟程度对再生具有一定影响。不同外植体的大小产生的不定芽数量有显著差异。菊花外植体成熟程度影响再生率，再生的潜力随叶片和茎段成熟度的变化而变化，通常与未成熟和成熟的2个阶段相比，半成熟的阶段具有较高的芽再生率。如，成熟和半成熟的叶片和茎段再生的潜力随外植体成熟程度的增加而下降。季节对外植体的再生率也有影响，如冬季取得的外植体比夏季能够再生出更多的芽。1.1.3体外质的诱导培养植物体细胞胚状体具有很强的接受外源DNA的能力，是理想的基因转化感受态细胞。同时，胚性细胞繁殖量大，同步性好，遗传转化获得的阳性植株嵌合体少。因此，体细胞胚诱导条件的探索，成为作物基因工程改良重要的基础性研究工作。菊花体细胞胚诱导最早的成功报道是1991年，到目前为止，体细胞胚途径高频再生体系的建立已在多种外植体上获得成功。如，叶片、茎段、小花等（表2）。研究指出，高浓度的细胞分裂素类物质可以诱导体细胞胚的发生。如，以菊花品种‘Polaris’、‘Hekla’和‘Iridon’的叶片为外植体，在MS+1.0mg·L-12,4-D+0.2mg·L-1BA的培养条件下，成功诱导了体细胞胚的发生。笔者以地被菊花‘FallColor’叶片为外植体，在添加0.75mg·L-12,4-D的诱导培养基上诱导15d，再进行分生培养，不仅能够诱导胚性愈伤组织形成，还能够诱导胚状体发生，并进一步诱导芽再生，最终93%的供试外植体通过胚状体途径获得芽的再生。菊花体细胞胚状体发生也受光周期和蔗糖浓度的影响。诱导培养先在黑暗中28d，然后再进行10d的光照，在含有9%～18%蔗糖浓度的培养基中，可获得高频的体细胞胚状体发生。在菊花再生体系建立的过程中，往往是器官直接、间接途径同时发生，甚至在体细胞胚的诱导中也伴随着器官发生途径的发生，如组织培养中会观察到器官混合发生反应，即芽、根、愈伤和胚胎一起形成，或多器官形成的现象，这主要是初代外植体细胞具有异质特性的影响。这一现象可以通过添加单一的植物生长调节剂或利用薄细胞层培养得到抑制。1.2结构外植体的易感性菊花属于双子叶植物，是农杆菌的良好寄主，因而农杆菌介导的遗传转化便成为菊花遗传转化的有效途径。这一转化途径包括外植体的选择、抗生素的确定、易感菌株的筛选、外植体的预培养、外植体与农杆菌共培养条件的确定等。因此，一个高效的遗传转化体系是建立在优化各个环节的基础上。外植体的选择是遗传转化的第一个环节，迄今为止，在叶片、花、愈伤组织上获得了成功。菊花外植体对抗生素的敏感性研究报道最早见于1975年。此后，相继对此进行了研究。抗生素的种类和浓度都影响外植体的存活和再生。笔者以地被菊花‘WhiteSnow’叶片为受体材料，通过抗生素二次筛选法，即10mg·L-1Kan选择压筛选抗性愈伤组织或抗性芽，15mg·L-1Kan选择压筛选抗性植株，10mg·L-1Kan下生根，获得了较高的转化效率。在易感菌株的筛选上，不同菊花品种对不同农杆菌敏感性差异很大。在14种菊花基因型对根癌农杆菌的易感性研究中，只有少数基因型和菌系的组合能够诱导肿瘤的形成。农杆菌菌种Chry5和B6对85个菊花品种的侵染试验中，只有42%的品种形成肿瘤。所以在进行遗传转化试验前，筛选易感菌株是非常必要的。延长外植体的预培养时间可以增加抗性愈伤的诱导率，但同时会降低芽的再生率。笔者以菊花‘WhiteSnow’为试材，探讨了叶片外植体预培养时间，所得结果是，预培养2d为最佳预培养时间，所得抗性芽再生率最高，为8.8%。延长共培养的时间在促进菌株侵染外植体的同时，也会降低外植体的分化能力。如，采用毒性较强的菌株EHA101进行转化时，短期的共培养有助于保持外植体细胞的脱分化能力。笔者以菊花‘WhiteSnow’叶盘为外植体的研究中，共培养2和3d的叶盘，有较高的抗性愈伤发生率，分别为24%和18%，但只有共培养2d的叶盘获得5%的抗性芽。此外，根癌农杆菌浓度和侵染时间，植物生长调节剂的使用等因素也影响到转化效率。菊花遗传转化成功的机理还不明确。2观赏特性类大学生观赏特性比较观赏植物的价值首先体现在观赏特性，花色、花型、株高、株型、花期等均是观赏特性的重要组成部分。菊花观赏性状基因工程改良方面的研究报道，起始于20世纪90年代初，近20年来，在下述几个方面做了较多工作（表3）。2.1以结构因子为原料的菊花生产色花色与花瓣色素的种类与含量、花瓣内部与表面的构造等多种因子有关。已经明确花色素合成的启动和终止是由主效基因控制的。目前已经克隆到较多的影响花色苷代谢的基因，如查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、二羟基黄酮还原酶（DFR）、黄烷酮-3-羟基化酶（F3H）、类黄酮-3′，5-羟基化酶（F3′5′H）、花青素合成酶（ANS）、类黄酮3-O-糖基转移酶（3GT）、pH增调基因（pH6）等基因。有报道表明，菊花的白色是由于类胡萝卜素合成后随即被降解为无色物质而产生的，因此，当类胡萝卜素裂解双加氧酶（carotenoidcleavagedioxygenase）基因被沉默后，花色会由白色转变为黄色。将查尔酮合成酶基因（CHS）导入菊花，能够使花色发生改变，出现转化前没有的紫色、白色以及浅粉色。在花色的基因工程改良中，共抑制现象较为多见。发生共抑制时，外源基因的过量表达抑制了内源同源基因的表达，从而使转基因植株的花色不但颜色没有加深，而且出现杂色甚至白色的现象。2.2超基因型基因在菊花中表达盆栽菊或绿化用小菊，要求矮化或分枝性强。近来，从拟南芥突变体中克隆到多个GA不敏感基因，包括具有GA负调节（spy）、茎短缩（shi）、GA不敏感（gai）、节间短缩（rolC）等功能的基因。这些基因在菊花中的异源超量表达导致了受体植物的株型矮化（表3）。如，rolC基因转入菊花得到了株型变矮、分枝紧凑、花瓣变宽的菊花新材料。gai基因的转入，获得了明显矮化的植株，并且转基因植株对外源施加的GA在株高、节间长度、花茎大小等形状上表现不敏感。此外，光敏色素phy-B1基因转入菊花后抑制了植株的生长。2.3tvifygene型超基因从模式植物拟南芥突变体中分离得到的与开花诱导相关的基因可以分为2种类型，即与开花时间相关的基因（floweringtimegene）和与分生组织特征相关的基因（meristemidentifygene）。前一类基因的突变会使突变体的开花时间提早或推迟。其中，促进开花的基因包括CONSTANS(CO）、FCA、ELF3等，抑制开花的基因有EMF1等。后一类基因决定原基发育的分化方向，即继续进行叶原基分化还是向花原基方向转变，这类基因如CLF、LEAFY(LFY）、APETALA1(AP1）和AP2等。如将拟南芥LFY基因转入菊花，不同转基因株系之间在开花提早与延迟方面存在很大差异，有的株系比对照提早开花65、67、70d，而有的株系推迟开花78、90d。又如把水稻光敏色素基因phyA和拟南芥phyB基因转入菊花，转基因植株的生长习性发生了变化。2.4乙烯受体基因：对菊花发育的影响菊花花朵开放期相对较长，但是叶片容易因自然衰老而出现黄化，甚至出现脱落现象，成为菊花采后瓶插寿命的限制因子。因此，菊花采后保鲜的关键在于叶片。菊花为典型的乙烯不敏感型种类，通常乙烯对菊花的花朵开放不产生影响，但是乙烯能够加速菊花叶片的衰老、促进形成离层而脱落。将菊花中克隆出的乙烯受体基因mDG-ERS1转入菊花品种Sei-Marine中，获得了对乙烯敏感性降低的转化株，叶片的寿命也因此而延长。将异戊烯基转移酶基因（ipt）导入切花菊品种秀芳，ELISA检测结果表明，转化株衰老同期叶片内源iPAs含量是对照株的4.7倍；同时，转化株的株型、叶色、花芽分化等性状与对照相比差异明显，叶片在花芽分化期、盛花期和衰老期总叶绿素含量分别是对照株的1.5、2.3和2.6倍。3相关基因的遗传转化，如菊花农业形态3.1水稻抗真菌基因检测目前，菊花抗病毒基因工程研究主要策略是将病毒本身的基因导入受体植物后获得抗性植株。如，将编码TSWV、INSV、GRSV这3种病毒外壳蛋白的基因导入菊花品种‘Polaris’、‘GoldenPolaris’和‘Iridon’中，分别获得了158、66和277株转基因植株，转化株具有不同程度的TSWV抗性。锈病和灰霉病是菊花在生育期内常见的真菌性病害。在菊花抗真菌病害基因工程育种中，应用最为广泛的是几丁质酶基因（chitinasegene）。用根癌农杆菌C58和MP90将水稻几丁质酶基因OsRCC2导入菊花‘Yamabiko’中，得到11个对灰霉病（Botrytiscinerea）具有不同抗性的转基因株系。在3个较强灰霉病抗性的株系中，ELISA检测发现RCC2蛋白量高于对照，表明OsRCC2基因可以用来改善菊花的灰霉病抗性。将来源于酵母的pac1基因导入菊花品种‘Regan’，获得了对菊花矮化类病毒具有抗性的转基因植株。此外，将兔防御素NP-1基因导入菊花品种001中，获得了对细菌和真菌产生抗性的转化植株（表4）。3.2内毒素基因检测在农作物抗虫基因工程育种中应用的基因主要有3类：一是从微生物苏云金杆菌分离出来的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因，简称Bt基因；二是来源于植物和动物的抗虫基因；三是植物凝集素基因。在菊花上应用最广泛的是Bt基因。该基因能够产生δ-内毒素，对鳞翅目幼虫有毒害作用。如用农杆菌A281/pCP01-GT携带苏云金杆菌内毒素基因BtⅡ转化菊花品种‘WhiteHurricane’，在生物检测中分别用转化愈伤和对照饲喂绿棉铃幼虫，在对照植株中的幼虫长度和重量分别是转化株的9倍和80倍。将从苏云金芽杆菌中克隆到的编码杀虫蛋白Cry1A(b)致毒区段的3`平端结晶蛋白基因，用致癌农杆菌介导转入菊花获得了相似的结果。又如将Cry1C基因转入菊花后，用转基因植株叶片喂养甜菜夜蛾幼虫，幼虫的重量比对照轻，且幼虫在未成熟前死亡（表4）。3.3土地胁迫和诱导基因家族在基因表达中的应用非生物胁迫包括高温、低温、干旱、盐渍等因子。植物在长期进化过程中形成了对逆境的响应机制。与逆境诱导相关的基因产物可分为两大类：第1类为直接保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白，如水通道蛋白，合成渗透保护剂的各种酶类，LEA蛋白和脱氧化酶等；第2类主要包括在胁迫信号转导和基因表达中起调节作用的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子以及参与磷脂代谢的酶类。与此相对应，利用基因工程来提高植物的非生物胁迫耐性通常有两个大的思路：其一是导入直接保护细胞免受伤害的功能基因，如与干旱耐性相关的脯氨酸、甜菜碱合成酶基因；其二是导入与胁迫信号转导相关的基因，如DREB基因。研究证明，植物非生物逆境耐性的响应，通常是多基因控制，因此通过单个功能基因的导入来提高植株对非生物逆境的效果往往非常有限。但是，转录因子具有总开关（masterswitch）的作用，能够通过调节下游多个逆境应答基因的表达，有效增强植株对逆境的耐性，这为利用基因工程手段改良植物对逆境的耐性，提供了更加有效的手段。模式植物研究表明，当植物受到干旱、低温、盐渍胁迫时，主要的胁迫响应途径包括ABA依赖的胁迫响应途径和ABA不依赖的胁迫响应途径。在低温胁迫中，以不依赖ABA的信号转导途径，即DREB介导的途径为主；干旱胁迫中，以ABA依赖的胁迫响应途径为主，同时存在一条ABA不依赖的DREB胁迫响应途径和低温信号产生交叉。对于高温胁迫研究，主要集中在热激蛋白、抗氧化系统、膜脂的饱和度对植物高温耐性的影响上。最新的研究表明，DREB转录因子不仅在干旱胁迫下起作用而且在高温胁迫中被诱导表达，可见，干旱和高温胁迫响应途径也存在交叉。DRE，最初由Yamaguchi-Shinozaki研究小组于1994年从拟南芥rd29A基因的启动子中发现，共包含9个碱基，TACCGACAT。之后，在许多与干旱和低温诱导相关的基因启动子中也相继发现了DRE核心序列CCGAC。DREB1蛋白结构分析表明，该蛋白的N末端富含碱性氨基酸，是核定位信号区；C末端富含酸性氨基酸，作为转录激活区；中间有约58个氨基酸残基组成的高度保守的ERF/AP2区域，作为DNA结合域，隶属于一个大的植物特异转录因子多基因家族AP2/EREBP中EREBP亚家族。DREB1转录因子启动下游基因的原理是：DREB1受低温迅速诱导表达，通过其ERF/AP2DNA结合域特异性地结合下游基因启动子中的DRE元件，进而激活下游基因的表达，最终提高植株的综合耐性。DREB基因家族的发现以及DREB1A的遗传转化所带来的前所未有的逆境耐性的增强，被认为是20世纪90年代分子育种工作中一个重要的里程碑。洪波等使用分别由35S和rd29A为启动子驱动的AtDREB1A转化载体，以幼嫩叶片为外植体，通过根癌农杆菌介导法和体细胞胚状体途径将逆境诱导转录因子DREB1A导入地被菊花‘FallColor’，获得19个35S:DREB1A转基因植株和15个rd29A:DREB1A转基因植株。半定量RT-PCR分析检测到在胁迫条件下，AtDREB1A基因在35S:DREB1A转基因植株中呈现组成型过量表达，而在rd29A:DREB1A植株中则是受胁迫诱导型过量表达（表4）。利用土壤干旱胁迫法、人工气候室法等，测定形态指标、生长指标、在干旱胁迫下对转化株体内渗透调节物质脯氨酸含量和抗氧化酶类物质超氧化物歧化酶SOD活性进行测定，确定了地被菊花抗旱性鉴定指标，比较转基因植株的抗旱性结果表明：上述生理指标的变化与外源基因的表达相关，转基因植株对土壤干旱的胁迫耐性明显增强。人工气候室内土壤干旱胁迫处理7d，植株成活率与对照植株相比提高了54%。此外，在低温胁迫下，对转基因植株盆栽幼苗进行-4℃和-8℃分别12h的耐寒特性鉴定，其中转基因植株的存活率比对照分别高53%和38%，表明转化株具有极强的抗冻能力。4菊花互补基因工程的未来规划4.1通过基因改良种子生产技术生产适合的花芽关于菊花的花色，总体说来已有的国内外资源已经非常丰富，但是一些花色依然缺乏，如蓝色、亮红色等。而通过常规育种方法确难以实现特异花色的育种目标。因此，充分利用模式植物已有的基因资源，并进一步从菊花中发掘相关基因，进而进行基因的遗传转化，将成为菊花花色基因工程育种的重要内容。理想的标准菊，即独头菊品种应当是植株的顶端优势极其明显，不容易形成侧芽。但是，目前的品种中，多为分枝能力很强的品种。因而，在切花菊的生产实践中，人工去除侧芽耗费了大量的劳动成本，影响规模化生产。欲进行这一性状改良，常规杂交方式是很难实现的。这一点，在模式植物上已经进行了大量的研究，一些基因在改良植物分枝问题上，已有成功的例证。如，生长素相关的色氨酸单加氧酶（tryptophanmonooxygenase）基因导入烟草后完全抑制了烟草侧芽的生长。可以利用这些研究成果，对菊花进行基因改良，有可能选育少侧芽或无侧芽品种。菊花的大部分类型呈现比较严格的短日照特征，在自然日照情况下，进入秋天短日季节才能分化花芽。如果在夏天长日季节生产菊花，就需要采取遮光等措施，不仅费用高昂，产品质量往往得不到保障。于是，人们已经致力于通过基因的遗传转化选育光周期钝感型品种。已经明确模式植物拟南芥中控制开花诱导的4条主要途径，即包括光周期途径、春化途径、自主途径和GA途径。因此，进一步了解