蝴蝶兰组织培养技术研究进展

蝴蝶兰组织培养技术研究进展

蝴蝶兰属植物，属于兰科。该属约有40余个原种,分布于亚洲与大洋州热带和亚热带地区。我国云南南部、西藏南部、广东南部、海南及台湾为该属植物的最北分界线。其多生于阴湿多雾的热带森林中离地3～5m的树干上,也有长于溪涧旁的湿石上,具有极高的观赏价值和经济价值。蝴蝶兰为典型的单茎性热带附生兰,植株很少发生侧枝,分株繁殖系数极低;其种子内不含胚乳,自然条件下很难萌发,发芽率极低,故自身的营养繁殖和种子繁殖均难以满足大量繁殖的需要。种子无菌播种萌发产生实生苗变异性大,不能良好的保持母本植株的品种特性,也会出现品种退化的现象,导致种苗质量差。应用植物组织培养技术进行蝴蝶兰快速繁殖可以缩短繁育周期,获得大量成株,并且可以保持优良性状,维护种质资源,从大量的繁殖后代中得到一定数量的突变体,随之对其特殊性状进行较为深入的分子水平上的研究,获得更为有价值的成果。目前,蝴蝶兰快繁途径主要有:利用各种外植体诱导类原球茎,进而诱导分生苗实现快繁,不经愈伤组织直接诱导丛生芽,近年来,也出现通过诱导愈伤组织途径进行植株再生的研究以及花葶培养、试管分株等方法。1利用其它器官培养自从1949年Rotor利用无菌培养技术成功地在试管中将蝴蝶兰花梗上的休眠芽培养出完整植株后,国内外学者纷纷对蝴蝶兰的组织培养技术进行相应研究。Intuwong等利用蝴蝶兰的茎尖进行研究,成功地得到完整植株。随着科学技术的进一步发展,国内外以蝴蝶兰茎尖为外植体的研究逐渐增多。尽管茎尖及其周围组织较为幼嫩,容易脱分化并再分化成完整植株,但蝴蝶兰为单茎性植物,摘取其茎尖就有可能损失母株,造成浪费。因此,在实际应用中,蝴蝶兰的茎尖培养可以用其它器官培养代替。利用花梗及花梗芽作为外植体进行培养就是代替蝴蝶兰茎尖培养的一种研究方法。许多研究结果表明,在诱导花梗苗的过程中,蝴蝶兰不同发育阶段的花梗芽及侧芽均可以进行试管内的营养繁殖,但还是有少量的花梗芽仍保持休眠状态。同时,培养温度及植物生长调节剂浓度都是影响休眠芽萌发的关键因素,并且外植体褐化严重。因此,花梗芽的诱导受到一定的限制,而以花梗为外植体的研究中同样出现了极为严重的褐化现象,并且难以诱导形成类原球茎。然而,以花梗芽为外植体时,无论从不定芽分化繁殖还是诱导形成类原球茎繁殖,都具有繁殖周期短,不伤害母株并保持母体优良性状,形成的新植株健壮易于移栽等优点,因此,是较为理想的外植体。在蝴蝶兰的快繁研究中,还有利用根尖、根段和叶片分别作为外植体进行培养的。以上3种器官为外植体,对母株基本上不会有太大的影响,而且可以保持母株的优良性状,同时也不会受取材时间的限制,可随时进行研究,是比较好的外植体。目前,已经建立起来的无性系繁殖体系,增殖系数还不是很理想,并且繁殖周期一般比较长。因此,仍然需要进一步的研究。目前,利用胚培养(即无菌播种)对蝴蝶兰进行组织培养研究也比较普遍,并取得了一定的成果。但是,由于商业上所使用的观赏性蝴蝶兰多为杂交种,胚培养会产生性状分离,难以获得整齐均一的试管苗,有些后代甚至会失去观赏价值。因此,在繁殖优良品种时,应以根、花梗等器官作为外植体;而胚培养技术多应用于杂交育种中,来克服杂交的不亲和性,缩短育种时间。2物组织培养方面的应用类原球茎(Protocorm-likebody,PLB)是兰科植物组织培养中所产生的特有现象,也是兰花快繁技术中的一个重要形式。Ishii等对蝴蝶兰组织培养中产生的类原球茎进行组织学研究时观察发现,该类原球茎的解剖结构与体细胞胚的结构相似,即类原球茎为体细胞胚。2.1植物生长调节剂在蝴蝶兰组织培养研究中,类原球茎的诱导是在基础培养基内添加一定种类及浓度的植物生长调节剂,由幼叶、根、茎尖等外植体脱分化而产生胚性愈伤组织,进而形成原球茎体。研究中常用的基础培养基有MS、改良VW、G3、B5、KnudsonC等,植物生长调节剂有6-BA、NAA、KT、2,4-D等。同时,不同外植体部位对类原球茎的诱导也有一定的影响,见表1。除上述几种影响因素外,研究还发现培养基的pH值以及外植体的摆放也是蝴蝶兰类原球茎诱导的重要影响因素。在蝴蝶兰的组织培养中,需根据不同的培养材料和培养基探索合适的pH值,其范围一般在5.1～5.4之间。同时,外植体在培养中出现了极性现象,因此,在接种时应注意摆放的方向以适应外植体自身的极性特点,利于诱导产生类原球茎,如正放在培养基内的叶片类原球茎的诱导明显高于反放和斜放在培养基上的叶片,反放和斜放的叶片在培养中几乎不能诱导出类原球茎。2.2植物生长调节剂的使用在蝴蝶兰的快速繁殖研究中,影响类原球茎增殖和分化的因素较为复杂,导致其增殖系数一直未得到较大的提高。主要因素有增殖培养基的选择、类原球茎切割体积、培养的环境条件、外植体的选择以及试验中所使用的蝴蝶兰品种等。研究结果表明,类原球茎增殖的最适培养基会因蝴蝶兰品种的不同而异。对于蝴蝶兰类原球茎增殖培养基中植物生长调节剂的配比及添加量,一些研究者认为,PLB增殖需要低浓度的植物生长调节剂组合,以免在长期培养时出现变异苗。还有研究者在进行PLB增殖培养时发现PLB可以在原诱导培养基上继续增殖,但适当降低外源细胞分裂素的浓度会使PLB增殖效果更佳,其增殖系数在2个月内能达到4倍以上,并且当PLB增殖后转接在新鲜培养基上,就会陆续发芽,从而诱导出完整植株。在培养基内添加一定浓度的无机和有机物质,如活性炭和椰子汁等,会在一定程度上促进类原球茎的增殖与分化。这些物质可以有效防止组织褐化,从而促进类原球茎的增殖。在PLB增殖培养中,还应该注意PLB切块的大小,以及其表现出的一定的群体效应。蝴蝶兰类原球茎的分化相对容易,在诱导培养基或增殖培养基甚至是无植物生长调节剂的基础培养基上均可以分化,将产生的芽转入生根壮苗培养基内,即可形成完整的植株。生根壮苗培养基中使用效果较好的基础培养基是Kyoto和G3,植物生长调节剂的配比是6-BA0.1mg·L-1+NAA0.5mg·L-1。在此条件下,Kyoto培养基有利于生根,G3有利于壮苗。在培养基内加入一定浓度的活性炭有助于根系的形成;加入果蔬汁能明显的促进试管苗的生长和根系的形成。3不同浓度的温度对乳状变化的抑制率及相关因素的影响不经过愈伤组织直接诱导丛生芽或通过诱导花梗芽使之产生丛生芽的方法是蝴蝶兰的又一种快速经济有效的快繁方法。丛生芽诱导是关键环节,花梗芽以及植物生长调节剂浓度都是影响丛生芽产生的主要因素。花梗芽离体培养时,腋芽受到温度、节位和6-BA浓度的影响。在离体培养条件下,低温有利于成花基因的启动,易于获得花枝;而保持20～28℃的较高温度,易于获得营养枝,腋芽节位以下第3、4节相对容易诱导,而向上越接近顶芽的腋芽诱导萌发越困难,且容易褐化死亡。一定浓度的6-BA有助于打破腋芽的休眠,随其浓度的升高,丛生芽的增长率也随之上升,但褐化率也显著增加,因此,筛选适宜的6-BA浓度对蝴蝶兰丛生芽的诱导有很大的影响。诱导丛生芽进行蝴蝶兰的快速繁殖具有技术难度低、遗传稳定等优点。笔者通过一年半的比较发现,以蝴蝶兰的叶片、根和花梗节间切片作为外植体快速繁殖蝴蝶兰,诱导时间长,外植体容易褐化死亡,效果不好。而利用花梗芽诱导丛生芽快繁蝴蝶兰,繁殖周期短,效果最好,但产生的丛生芽都是无根小苗,需要进一步生根壮苗才能移栽。4基因型附生兰种子萌发和接种兰花种子萌发有共生萌发和非共生萌发(无菌播种)两种。共生萌发是把真菌和兰花种子共同接种在培养基上,由真菌侵染种子,种子在真菌作用下萌发成苗的方法,该方法对于地生兰是非常有效的。无菌播种(即胚培养)是将兰花种子接种到适宜培养基上,结合一定的培养条件诱导萌发的方法,该方法适于大多数热带附生兰的种子萌发。蝴蝶兰具有种子小、数量多、容易获得等优点,比较适合无菌播种,可得到大量的实生苗,但所获得的植株可能与母株基因型不同,一般不宜进行再繁殖。蝴蝶兰进行种子无菌播种时,最重要的影响因素是培养基。种子的采摘在授粉后110d到种子成熟期间,一般在授粉后120d时较为适宜。这一时期,蝴蝶兰种子已经基本达到了生理上的成熟,且有外部果皮包被,因此可以直接进行果实消毒。蝴蝶兰种子在MS、1/4MS、Vacin&Went和KnudsonC几种基础培养基中,均发芽良好。且在基础培养基中添加活性炭、香蕉泥和Tryptone有利于发育和生长。许多研究还发现,低氮浓度较有利于种子发芽和类原球茎发育。5继续发展中的类原球茎增殖体系蝴蝶兰组织培养是20世纪60年代末才发展起来的技术,在40多年的时间里得到了长足的发展,世界各国纷纷进行研究与生产,目前已经形成一定的规模,建立了较为完善的技术体系。同时,对于蝴蝶兰繁殖系数的提高也取得了很大的进步,但对于某些外植体的增殖系数仍然不是特别理想,需要进一步研究和完善。众多研究结果表明,蝴蝶兰的组织培养中仍然存在一些问题,如蝴蝶兰类原球茎诱导培养中所加入的添加物及其浓度对类原球茎的影响,虽然蝴蝶兰的繁殖系数有很大的提高,但组织培养中类原球茎增殖的稳定性不强,试验结果重复性不十分理想等。因此,对蝴蝶兰快速繁殖技术中一些影响因素应该进行更加细致的研究,建立更加完善和科学的体系,用以更好地、快速地、大量地繁殖蝴蝶兰的稀有优良品种,进而保护和维持蝴蝶兰的原生种及丰富的品种资源。与此同时,在快速繁殖蝴蝶兰的过程中,还应注意蝴蝶兰母本植株的病毒鉴定,防止病毒通过分生苗的大量繁殖迅速传播扩散。目前,蝴蝶兰的数量急剧上升,但规模