铁皮石斛组培快繁技术研究

铁皮石斛组培快繁技术研究

0发酵铁皮石斛组培技术剥皮属植物，又称剥皮枫斗和黑节草，主要分布在云南、安徽、贵州、浙江、江西、广东、广东等地。它不仅是一种珍贵的室内蔬菜，也是一种珍贵的中药。据《农业和畜牧业》记载，剥皮石斛具有滋阴清热、益津益胃、润肺止咳、润肠明利、寿命等功效。天然状态下主要生长于悬崖峭壁上,自然繁殖力低,加上药农掠夺性挖采,造成自然资源匮乏、濒临绝迹的境况。而常规条件下人工繁殖又较难,长期以来组织培养在植物生产中得到广泛应用,是产生极大经济效益的一项生物技术。从20世纪90年代初起,铁皮石斛组培技术方面就有报道,主要以单一外植体进行组织培养、诱导方式,培养配方研制、生根壮苗、栽培管理、工厂化育苗技术等方面研究较多[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14]。本次利用不同外置体的组培繁育过程比较,综合2种外植体建立繁育体系过程中的差异进行系统分析还未见报道。因此,本研究旨在对利用不同外植体建立的组培繁育体系进行比较研究,建立稳定、高效的组培繁育体系,为专业化、规模化繁育种苗提供物质和技术参考。1试验材料和方法1.1试验材料一是铁皮石斛成熟种子,二是1年生铁皮石斛植株茎段。1.2测试方法1.2.2培养基制备(1)外植体诱导培养基培养基(6)~(7):MS+BA0.0~2.0mg/L+IAA0.1~2.0mg/L。(2)改性处理u2004培养基(1)~(5):MS+BA0.2~2.0+NAA0.1~2.5+土豆汁10%~50%;培养基(6)~(9):MS+BA0.2~2.0+NAA0.1~2.5+香蕉汁10%~50%。(3)+红豆汁培养基(1)~(3):1/2MS+NAA0.0~2.5+土豆汁10%~50%+活性碳0~10‰;培养基(4)~(5):1/2MS+NAA0.0~2.5mg/L+香蕉汁20%+活性碳0~10‰。(4)ph值/l所有培养基中添加蔗糖3%,卡拉胶6.8g/L,pH值5.2~5.6。培养温度23~25℃,光照强度2000lx,光照时间10h/d。1.2.5苗苗移栽基质消毒(1)炼苗:将生根瓶苗在移栽前的7~10天放在温室大棚中培养,炼苗。(2)组培苗移栽:组培苗移栽基质为苔鲜、松树皮、木屑分别与碎石块及粗河沙混合。用甲基托布津粉剂600倍稀释液将移栽基质喷洒消毒2天后再移苗。移栽时,分别种子和茎段2种外植体获得的生根苗进行,要求移栽条件相同,30天后统计其移栽成活情况。2结果与分析2.1种外植体的诱导发生途径从表1可以看出,本试验所设计使用的培养基都能将种子及茎段外植体诱导出芽,且诱导率在75%以上,但激素种类以BA、NAA组合为好(培养基(1)~(3))。2种外植体在同一种培养基上其诱导时间、诱导率和生长情况等方面存在显著差异,总体而言,茎段外植体优于种子。种子诱导出无菌苗的时间在20~35天之间,而茎段的诱导时间在5~11天之间;种子诱导率为75%~90%,茎段为90%~98%;2种外植体的诱导发生途径也不同,种子外植体需经过种子胚萌发→愈伤组织诱导→原球茎诱导→原球茎分化→发芽等过程,而茎段外植体自植入培养基中10天后,其茎节部芽体就出现突起,并产生丛生芽族,不仅生长快,而且芽体粗壮,30天后能生成健壮完整的芽体,不需要经历原球茎诱导阶段。综合分析诱导时间、诱导率及无菌苗后续生长情况,认为MS+BA1.0+NAA0.5是最适宜铁皮石斛种子和茎段外植体建立无菌系的诱导培养基,且就无菌系建立效率而言,茎段外植体优于种子。2.2红豆汁添加量的确定前已述及,以种子为外植体的繁育途径为:种子胚→愈伤组织→原球茎→壮苗→完整植株,增殖周期一般在40~50天,增殖系数大(见表2,表3),但苗木细小,叶狭长,还要有一个壮苗过程。以茎段为外植体的繁育途径相对简单,即:茎段→丛生芽→完整植株,虽然平均增殖系数小(表2,表3),但增殖周期短,只需30天,叶浓绿,苗木生长健壮,不需经过壮苗可以直接用于生根。在增殖培养基中添加适量的土豆汁比香蕉汁的效果好,增殖系数高,无菌苗生长正常,不出现茎粗短、玻化、黄化及水渍状等情况,茎节间长而粗壮。对用种子外植体建立的繁育体系而言,不加土豆汁其原球茎分化不明显,且原球茎个头小,但过量添加土豆汁又易在培养基底部形成悬浮物,使苗木出现黄化现象,且污染较为严重。试验结果表明,土豆汁的适宜添加量以10%~20%为宜。综合各因素,认为铁皮石斛增殖培养,以茎段建立的繁育体系,在MS+BA0.5+NAA0.2+土豆汁10%~20%的培养基中进行增殖培养较为适宜。2.3香蕉汁、活性碳的生长情况对生根的影响由表4可以看出,生长素NAA的浓度在一定程度上影响着组培苗的生根时间、根系数量和瓶苗生长情况等,试验表明,NAA适宜浓度为0.2~0.5mg/L。影响铁皮石斛生根的因素还在于适宜、适量的添加物,结果表明,香蕉汁20%+活性碳2.0‰有利于生根,不仅气生根发达,而且苗木生长健壮。综上而言,以培养基(4)(1/2MS+NAA0.2~0.5mg/L+香蕉汁20%+活性碳2.0‰)生根效果最好。由2种不同外植体建立的繁育体系,其生根情况有差异。用种子外植体繁育的增殖苗进行生根培养后,其根系数量仅为3~4条,且根系呈细小线状,或出现杆粗叶肥厚、多肉水渍等现象;用茎段外植体繁育的瓶苗在增殖期间就有根系出现,进入生根培养基培养后,基部的气生根更发达,根系数量多达20~30条,且在根系上有白色粉末状,瓶苗叶片光亮,茎粗,节多,有利移栽。因而,由茎段建立的繁育体系比由种子胚建立的繁育体系生根效果更好。2.4苗木生长特性就移栽基质而言,组培苗移栽后的生长情况表明:3种移栽基质对移栽成活率的影响差异不大。但木屑因未经腐熟消毒处理,较易发霉、生虫而引起茎部位腐烂,移栽成活率相对较低;松树皮透气、排水性能较好,有利于石斛的气生根盘结生长,组培苗移栽成活率较高;苔藓的移栽效果介于二者之间。就不同外植体建立的繁育体系培育的苗木而言,在3种基质中,由茎段外植体繁育的苗木均比由种子繁育的苗木移栽成活率高(具体见表5)。这是因为由种子繁育的苗木其根系细长,数量少,单株移栽不易成活,一般要2~3株簇栽;而由茎段繁育的苗木移栽成活率可达75%左右,移栽后苗木生长快,单株移栽亦能成活,半年后基部萌发的新芽可达4~6个,容易形成簇生群体。3发酵时间及组培稳定性本试验结果表明:铁皮石斛形成的愈伤组织有群体效益,在培养容器中的分布密度和愈伤组织0.5cm2为宜;铁皮石斛在组培增殖和生根培养过程中需添加土豆汁等辅助物质,才能使组培苗正常生长;铁皮石斛的种子是呈粉状的,从表现性来看无法用肉眼观察出种子的品质好坏,若用种子做外植体进行组培繁育,无法预计培育的后代性状是否优良。用茎段为外植体建立快繁体系则具有较多的优点(诱导时间短、发生过程简单),在已知母本材料遗传特性的前提下,不存在分化的组织或基本植物结构的丧失,能够较好地保持母本的生物学性状和经济性状。随着近年来中药产业的蓬勃发展,人们在不断的开发挖掘铁皮石斛药用价值,企业也为提高其经济效益,确保铁皮石斛药材原材料基地的建设,盲目地进行规模化产业化生产育苗,而忽视了合理的繁育手段。一旦建立组培快繁体系,繁育的后代却无法保持亲本良好特性,这样的话前期工作将毁于一旦,还会带来巨大的经济损失,所以在良种选好的前提下需选择能最大极限的保持亲本的特性高效、稳定、经济合理繁育体系,来保持铁皮石斛资源达到长期有效地永续利用。本研究只在铁皮石斛繁育方法、遗传稳定性方面做了研究分析,还有待于进行组培苗成年个体的性状差异跟踪调查,组培成品苗药物活性提取及分析等方面进行全面的、更详细的研究。取铁皮石斛成熟蒴果,在超净工作台上用刀片将其剥开,将种子倒在无菌滤纸上并用无菌镊将其包好,放在无菌瓶中用75%的酒精消毒30s,0.1%的HgCl2消毒3~4min后,用无菌水冲洗5~6次,用镊子把滤纸夹出,打开,把种子播在无菌培养基表面。约20天后,发芽而又未被污染的小苗,即为建立的无菌系,用于进一步进行试验。1.2.1菌种增殖培养从1年生铁皮石斛植株上选择生长健壮的茎段,摘去叶片和膜质叶鞘,剪成约2cm长带节的小段,用洗洁剂清洗后置流水下冲洗20~30min。在超净工作台上用75%的酒精消毒30s,0.1%HgCl2灭菌5min后,用无菌水冲洗5~6次,放入垫有干无菌滤纸的培养皿中,以吸去多余水分,茎段两端各切去0.2~0.3cm,插入备好的无菌诱导培养基中,每瓶培养基插1个外植体。培养基(4)~(5):MS+BA0.0~2.0mg/L+IBA0.1~2.0mg/L;培养基(