差速离心法和密度梯度法提取完整叶绿体的比较

差速离心法和密度梯度法提取完整叶绿体的比较

叶绿体是植物细胞独特的能量转化细胞器，光合作用是叶绿体。具备高完整度的叶绿体的分离是光合作用及其调控机理研究中的一项经常使用的技术。关于此技术,国内外有不少报道是需用高速冷冻离心机,这就使这一技术的普遍使用受到了极大地限制。在参考文献的过程中,我们注意到利用普通的台式离心机也可以得到完整度、得率高的叶绿体。本着使叶绿体制备更加简单易行且叶绿体得率较高的目的,我们尝试在低速离心的基础之上,进一步探讨叶绿体制备方法的优化。1.材料和方法1.1植物材料选取早晨刚见太阳不久的菠菜叶片,以叶片挺拔厚嫩为佳。1.2试管架和量片的制备普通离心机、研钵、粗天平、显微镜、烧杯6个、250ml量筒1个、滴管20支、10ml刻度离心管20支、试管架5个、纱布若干、载片和盖片各4片、电子天平。1.3mol/l葡萄糖溶液、0.4ol/l甘露醇溶液ros0.35mol/L氯化钠溶液、0.4mol/L蔗糖溶液、0.4mol/L葡萄糖溶液、0.4mol/L甘露醇溶液(溶液中20mMtris、15mMNaCl、2mMEDTA、PH约为7.5)、80%丙酮、盐酸、氢氧化钠、石英砂、蔗糖。1.4方法步骤1.4.1研磨法lnacl溶液(1)选取新鲜的嫩菠菜叶,洗净擦干后去除叶梗脉,称10g至30ml0.35mol/LNaCl溶液中,装入研钵。(2)研磨匀浆。(3)将匀浆用6层纱布过滤至500ml烧杯中。(6)将上清液在3000r/min下离心20min。弃上清液,沉淀即是叶绿体(混有部分细胞核)。(7)将沉淀用500μl0.35mol/LNaCl溶液悬浮。1.4.2细胞、细胞核的分离(1)取10g菠菜功能叶用预冷的蒸馏水洗净后吸水纸擦干,液氮研磨后加入30ml悬浮液悬浮。(2)经多层纱布过滤,滤液先经500g4℃离心10min除去完整的细胞和细胞核等,保留上清液。(3)经1500g4℃离心15min弃去上清,沉淀转移到10ml的离心管中,用60%的蔗糖混合,使该混合物终浓度为55%。(4)往上面缓慢加入35%蔗糖溶液使之形成蔗糖密度梯度,4℃7000g离心1h,完整的叶绿体将出现在蔗糖密度梯度35%~55%两层之间的绿色层,(5)小心吸取上层蔗糖溶液后将叶绿体转移到另1支10ml试管中用悬浮介质重新悬浮,4℃7000g30min离心洗涤两次以除去蔗糖等杂质,所得沉淀即为叶绿体。1.5叶绿体提取的测试方法(1)取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上,加盖玻片后即可在显微镜下观察。(2)检测叶绿素确定叶绿体的得率。2.结果与分析2.1在正常光显微镜下观察在普通光镜下,可以看到叶绿体为绿色橄榄形,在高倍镜下可以看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒,即基粒。2.2叶绿体的观察在用分光光度计检测叶绿素含量之前,先进行镜下观察,以确保所得悬液中为完整叶绿体。如果所得悬液中为完整叶绿体则所测叶绿素含量的高低与叶绿体的得率成正向对应关系。2.2.1离心液浓度的影响在以蔗糖为介质的差速离心法的步骤(6)中,将上清液分别在2500r/min,3000r/min,3500r/min下离心20min,弃去上清液。据表1,可知3000r/min的离心条件下,叶绿体的得率较高。2.2.2不同糖醇介质对叶绿体分离的要求考虑到蔗糖、葡萄糖等物质,可能成为潜在的代谢产物,故一般避免用蔗糖和葡萄糖作为分离介质,而用山梨醇。但在制备完整叶绿体时,对糖醇介质的要求并不专一。下表所示为四种糖醇做等渗介质时所分离的完整叶绿体比较。据表2,可知不同介质之间的差别不是很大,相对来说氯化钠的提取效果较好而蔗糖的较差。2.2.3叶绿体分离得的纯度将最终所获悬浮液小心地移入底部放有100μl1M葡萄糖溶液的离心管中,使其处于上层,两层不混,再于1000r/min下离心30秒,弃上液。把叶绿体分离过程中第一次分离得到的完整叶绿体和第二次分离得到的完整叶绿体的纯度进行比较,结果表明,第二次离心后得到的完整叶绿体的纯度较高。这主要是因为第二次离心时破碎而密度较小的叶绿体不容易沉入密度大的葡萄糖溶液中,从而使沉淀中破碎叶绿体的比例减小。另外,也可以把第一次分离得到的叶绿体,再用等渗溶液洗涤,并以3000r/min再次离心,则可起“浮选”效果,使得完整叶绿体的纯度提高。2.2.4密度梯度溶液配制易出现问题由于密度梯度离心方法需要较高的离心速度而且密度梯度溶液的配制常出现问题,因此实验结果不理想。对比看来,差速离心的方法比较简单易行,且效果较好。3.叶绿体得率较高,一般要确定其材料的选择这次试验结果表明,通过不同转速条件下叶绿体提取效果的比较,3000r/min条件下,叶绿体的提取效果较佳。氯化钠、山梨醇做等渗介质的条件下,叶绿体的提取效果相对较好。叶绿体提取中,缓冲液发挥着极其重要的作用。试验中曾尝试不加缓冲液Tris、EDTA,用0.35mol/L氯化钠溶液做等渗溶液,结果很不理想。其他条件相同的情况下,加入Tris、EDTA缓冲液,叶绿体得率较高。叶绿体提取中,植物材料的选择也是十分重要的。菠菜和豌豆是分离完整质体的极好材料,期细胞中含有质体较小而且它们都能在不积累淀粉和酚类物质的条件下生长。菠菜的叶绿体湿重比率高,而豌豆容易生长。因此,叶绿体提取的优化方案应是:3000r/min的条件下离心,加缓冲液,选择好的实验材料,加保护剂,等渗溶液,并做进一步的纯化。(4)取滤液10ml在1000r/min下离心5min,弃沉淀。(5)