植物组织培养技术及常见问题

植物组织培养技术及常见问题

20世纪初，德国植物生理学家哈布兰特提出了等高植物器官和组织的可分为单一细胞的观点，并考虑到植物细胞的全能性理论，即接近细胞的可能性。在无数科学家的努力下,至20世纪60年代,终于用不同实验证实了植物细胞全能性理论,即植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组,并具有发育成完整植物的潜在能力。在此理论基础上植物组织培养技术产生并得到迅速发展。但在组织培养过程中,常发生菌类污染、褐变和玻璃化现象三大难题,严重影响了组织培养材料的正常发育,给组织培养带来了一定的困难。本文概述了植物组织培养技术及常见问题的解决措施。1利用人为控制环境条件生长植物组织培养是根据植物细胞具有全能性的理论,将植物的离体器官(如根、茎、叶、花、果实、种子等)、组织(如花药、胚珠、形成层、皮层、胚乳等)、细胞(如体细胞、生殖细胞花粉等)以及去除细胞壁的原生质体,在无菌条件下,经过人为控制环境条件,培养在合成培养基上(含有营养物质和植物生长调节物质等)对其进行克隆,使其生长、分化并成长为完整植株的过程。2培养室的设置植物组织培养需要有准备室、缓冲室、无菌操作室、培养室,另需要一定面积的试管苗驯化室、温室或大棚。外植体在无菌接种室经灭菌后,接种到无菌的培养基中;接种后的培养容器置放于可人工控制环境条件的培养室中,培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气等。3培训组织培训的操作过程3.1以生长新植株为原料的外植体技术再生植株用于进行植物组织培养的材料称为外植体。外植体分为两类,一类是带芽的外植体,如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等。培养过程中可直接诱导丛生芽的产生。此类外植体获得再生植株的成功率较高,变异性也较小,易保持母株的优良性状。另一类外植体主要是根、茎、叶等营养器官和花药、花瓣、花轴、花萼、胚珠、果实等生殖器官。这一类外植体需要一个脱分化形成愈伤组织的过程,愈伤组织经过再分化,形成丛生芽或产生胚状体,然后诱导长根,形成完整再生植株。外植体的取用与植株年龄、组织部位、取材季节以及植株的生理状态、质量,都对培养时器官的分化有一定影响。一般处于年幼阶段的实生苗比老龄的容易分化,生长的芽比休眠芽容易分化,顶芽比腋芽容易分化。3.2新培养基的发现。根据测定植物生长需要,在建立一个新的实验体系时,为了能研制出一种适合的培养基,最好先选用一种已被广泛采用的基本培养基(如MS或B5培养基)开始。当通过一系列的实验,对这种培养基做了某些定性和定量的小变动之后,即有可能得到一种能满足植物生长需要的新培养基。要严格按照培养基配方中的各成分比例及排列次序进行配置,并用高压灭菌锅进行彻底的灭菌。注意植物生长调节物质的种类和浓度对外植体的分化和增殖起到重要的作用,不同的植物种类对其浓度要求是有差别的,在实验中要对其做进一步的改良和探讨。3.3严格消毒处理植物组织培养能否取得成功的决定因素之一,就是保证培养物在无菌条件下生长。由于培养的植物材料大都采集于生长在自然环境下的植株,材料上常附有各种微生物,一旦被带入营养丰富的培养基,即会迅速繁殖滋长,造成污染,导致培养失败。所以培养前必须对外植体进行严格的消毒处理,消毒的尺度以既能全都杀灭外植体上附带的微生物,但又不伤害外植体的生活力为度。因此,必须正确选择消毒剂种类和浓度、处理时间及操作程序。目前,常用的消毒剂有酒精、双氧水、氯化汞、次氯酸钙、次氯酸钠等。具体消毒方法如茎尖、茎、叶片的消毒:(1)消毒前先用清水漂洗干净或用软毛刷将外植体上的尘埃刷除,茸毛较多的用皂液洗涤,然后再用流动的清水洗去皂液,洗后用吸水纸吸干表面水分;(2)进入无菌的接种室,用70%酒精浸泡外植体30-60秒钟,(3)取出后马上用0.1%-0.2%氯化汞消毒10-15min,或10%次氯酸钙饱和上清液浸泡10-20min,或用2%-10%次氯酸钠溶液浸泡6-15min。(4)消毒后用无菌水冲洗3-5次,用无菌纱布或无菌滤纸吸干水分后再接种。3.4光照强度及光照时间对植物生长的影响外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞,转放到无菌培养基上的过程。整个接种过程均需无菌操作。接种后的外植体放到培养室去培养,普通培养室要求每日光照12-16h,光照强度为1000-3000lx,光照强度及光照时间依不同植物种类的不同生活习性而不同,应注意设计对比试验得出适合的光照强度及光照时间;一般温度控制在25±2℃,低于15℃或高于35℃对生长都不利;要求室内保持70%-80%的相对湿度;为了解决氧气问题,在液体培养时用震荡培养,固体培养时最好采用通气性好的瓶盖或瓶塞。4植物组织培养中的一些问题和解决措施4.1复配培养基的贮藏4.1.l配制大量元素母液时,或者直接配置培养基时出现沉淀物可能是某些无机离子如Ca2+、SO2-4、Mg2+和PO2-4等在一起发生化学反应,产生不溶物。所以,母液配制或直接配置培养基时最好用纯度高的重蒸馏水溶解,药品采用纯度较高的分析纯,最好先用少量温水将各种无机盐类分别溶解后再按配方中所列的顺序逐个倒入,边倒边搅拌;另外,铁盐也易发生沉淀,需单独配置。4.1.2维生素母液中有菌类物质存在维生素母液贮藏过程中,逐渐有白色菌类絮状物出现,而使维生素营养价值大大降低,影响培养物的正常生长发育。避免措施是:尽量缩短贮藏时间,最好在1-2个月内用完;配制母液时用无菌蒸馏水配置,并贮藏在无菌的棕色试剂瓶中。4.1.3培养基灭菌前凝固,灭菌后不凝固现象一般培养基在高压灭菌过程中,其中的某些成分在高压环境下发生化学反应,致使培养基pH值向酸性一侧偏移0.2-0.8,pH降低而使琼脂凝固力下降,发生培养基灭菌前凝固,灭菌后不凝固现象。所以在调培养基的PH值时,要高于培养基配方所要求的pH值0.2-0.5。一般的培养基要求为5.6-5.8,最好把pH值调到6.0左右;若需灭菌后再加入一定量的植物生长调节物质,可适当增加琼脂用量。4.2植物组的污染和预防措施4.2.1做好滤灭菌不彻底的激素类及抗生素类等物质的防治可能是高压灭菌不彻底造成的,或经高压灭菌后的培养基加入了未经微孔滤膜过滤灭菌的或过滤灭菌不彻底的激素类或抗生素类等物质。预防措施是:严格高压蒸汽灭菌程序,保证灭菌时间:当高压灭菌锅内压力达到49.0kPa时,开启放气阀,将锅内的冷空气全部排出;当压力生至108kPa、温度为121℃时,维持20-30min,即可达到灭菌的目的。4.2.2接种操作的预防一般在污染部位有不同颜色的霉菌,多为真菌污染。造成真菌污染的原因多为周围环境的不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养容器口径过大、操作人员咳嗽或说话、接种操作不当等。预防措施是:保持接种室洁净,定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸消毒;在接种前用紫外灯灭菌20-30min;75%酒精喷雾杀菌降尘,超净工作台开启l5-20min后方可使用;接种人员最好戴上帽子和口罩,接种时禁止说话,手和袖口不要在材料和瓶口上方移动等。4.2.3外植体的消毒消毒一般菌类呈黏液状物,而且在接种后1-2天即可发现,多为细菌污染。可能因外植体消毒不彻底、操作人员手未彻底消毒、镊子消毒不彻底所致;。预防措施是:严格按消毒程序进行,对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体可加吐温-80等湿润剂的办法,增加其渗透性,以提高杀菌效果。一般用0.1-0.2%升汞作灭菌剂最好,因其穿透力强。另外,也可将外植体在室内或无菌条件下先进行预培养以减少材料的污染;如需到田间采取外植体,最好在晴天的下午进行,因材料经日晒后可杀死部分菌类。操作人员的手应经常用75%酒精消毒,镊子和接种针在使用前必须在火焰上灼烧,并每接种1-3瓶灭菌1次。4.3在培训过程中，很容易出现一些问题和预防措施4.3.1生长调节物质可能是因表面灭菌剂浓度过高、处理时间过长;植物生长调节物质用量过多;培养温度过高等因素造成的。可选用降低灭菌剂处理浓度或减少处理时间,适当降低激素浓度或降低培养温度等方法,以预防此现象发生。4.3.2外植体的培养褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活,使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质,以致培养基逐渐变成褐色,培养物也随之进一步变褐而死亡。它是植物组织培养的三大难题之一。影响褐变发生的因素极其复杂,随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状态等的不同,褐变的程度也有差异。所以,选择适宜的外植体并建立最佳的培养条件是防止外植体褐变最主要的手段。一般选择幼嫩的器官和组织做外植体,切取外植体时尽量减少伤口面积及选择适宜的消毒剂;适当降低培养基中无机盐浓度,降低PH值,降低细胞分裂素浓度等,可显著减轻培养物褐变;适宜的温度及在初始培养的1-6周内用暗培养或在150lx左右的光强下进行光培养可抑制酚类物质氧化。另外,对培养物进行连续转移,在培养基中加入抗氧化剂或活性炭,都可有效抑制褐变。4.3.3培养基细胞分裂素有的组培苗在多次继代培养中,其叶和嫩梢呈水晶透明或半透明,植株矮小,失绿,叶片卷缩,发生玻璃化现象。它和菌类污染、褐变统称为植物组织培养的三大难题。若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高,培养基中离子种类、比例不适,琼脂浓度低,温度过低或过高,光照时间过长及通气不良,易发生玻璃化现象。预防措施是:适当降低培养基中细胞分裂素用量;提高Ca2+、Zn2+等离子浓度,降低N与Cl元素的比例,降低铵态氮浓度,适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度;增加自然光照等,可减少玻璃化苗的产生。4.3.4植物组织培养在培养过程中,常发生组培苗难以生根的现象,可能由于生长的小苗本身能合成丰富的生长素的缘故。所以,将组培苗放在无激素的培养基上或使用1/2基本培养基培养可提高生根率;另外,在生根阶段的培养基中,将蔗糖的浓度降到1.0-1.5%,可促进植株增强自养能力,以诱导其生根。现今,植物组织培养技术已经渗透到植物生理学、遗传学、生物制药、植