玻璃化冷冻对卵母细胞形态及卵裂率的影响

玻璃化冷冻对卵母细胞形态及卵裂率的影响

母乳细胞超低温冷冻保存是保护品种资源、挽救濒危物种不可或缺的技术保证之一。它也是加快动物育种和胚胎移植技术产业化的重要组成部分。同时，它为现代生物技术的生产、反应和微针培养等提供了丰富而廉价的材料。通过对卵母细胞的冷冻保存,对探讨其低温生物学特性和体外受精机理的研究有着重要意义(李林凤等,2006)。此外,在医学上卵母细胞的冷冻保存将会为那些生殖障碍的病人提供一个生育的机会(Noyes等,2010)。卵母细胞的冷冻是借鉴胚胎的冷冻方法,但其效果水平还较低,目前,只有小鼠成熟卵母细胞的冷冻取得了较为理想的结果(Carroll等,1993)。牛、羊和猪等家畜冷冻卵母细胞的受精率、卵裂率和发育率相对较低,尤其是山羊卵母细胞的冷冻保存研究少且进展缓慢(孙琪等,2008;贾映辉等,2009)。本试验在前人研究的基础上,以冷冻环法冷冻云岭山羊不同发育时期的卵母细胞,比较不同时期卵母细胞的发育能力,从而为云岭山羊种质资源保存的研究奠定基础。1材料和方法1.1外科手术剪切除卵巢表面核心组织的清理本试验以屠宰场云岭黑山羊卵巢卵母细胞为试验材料。用切割法采集卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocytecomplexes,COCs)。将卵巢用含有50μg/mL硫酸庆大霉素的生理盐水洗净后,用外科手术剪剔除卵巢表面的多余组织,然后用生理盐水洗净,再用灭菌纱布擦干置于盛有抽卵液的培养皿中。在培养皿中用手术刀片切开卵巢表面2～5mm的卵泡,并用镊子将卵泡液挤压出来。切剖完成后,在体视显微镜下检卵。根据试验需要吸取形态完整,细胞质致密,色泽均一,卵丘细胞在3层或3层以上,且包裹致密的COCs用于体外培养。1.2醇酯类化合物hgm抽卵液:PBS+36mg/L丙酮酸钠+1000mg/L葡萄糖+960mg/L青霉素+50mg/L链霉素,用前在37℃水浴锅预热。成熟液(OM):M199(Gibico)+1mmol/L丙酮酸钠+25mmol/L谷氨酰胺+0.075U/mL尿促性腺激素(HMG)(Sereno)+10μg/mL17β雌二醇(17β-E2)+10ng/mLEGF+1%ITS+10%FBS,pH控制在7.2～7.4,用前置于CO2培养箱中预先平衡2h。胚胎培养液(mSOFaa):SOF+2%EAA(V/V)+1%NEAA(V/V)+1mmol/L谷氨酰胺+10ng/mLEGF+8mg/mLBSA(不含脂肪酸)+1%ITS+10%FBS,pH控制在7.2～7.4,用前置于CO2培养箱中预先平衡2h。1.3培养条件将收集的COCs在D-PBS中洗3次,分别放入盛有50μLOM液的30mm培养皿中,在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养27h。将培养成熟的卵母细胞用PBS液清洗3次,放入含0.1%透明质酸酶的无Ca2+、Mg2+的PBS中消化2min,并用细管反复吹打除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞,吹打干净后,在PBS中洗3次,得到的裸卵在体视显微镜下,以异物针拨动卵母细胞进行观察,统计第1极体排出的卵母细胞数。1.4离子霉素减量原激素类型化msofaa的体外培养将体外成熟的卵母细胞作为对照组,用离子霉素(Ionomycin)联合6-DMAP激活。具体操作为:选择成熟的卵母细胞在含有5μmol/L离子霉素的mSOFaa液中处理5min,然后在含有2mmol/L6-DMAP的mSOFaa中培养4h,再用培养液洗3次后进行体外培养。用mSOFaa进行体外培养,48h记录卵裂数,5～7d记录囊胚发育情况。1.5冷冻液+20%egs+20%dmso冷冻基础液:M199+20%发情山羊血清(estrousgoatserum,EGS);冷冻平衡液:M199+20%EGS+10%DMSO+10%EG;冷冻液:M199+20%EGS+20%DMSO+20%EG+10mg/mL聚蔗糖(ficoll)+0.65mol/L蔗糖(sucrose)。将GV期或MⅡ期的卵母细胞用TCM199+20%EGS洗3次,然后移入冷冻平衡液,在34℃条件下平衡2～3min,再移入冷冻液中,随机取少量卵母细胞用于毒性试验,其余的将其放在含有冷冻液的铜环上,将冷冻处理时间分为20s和40s两组,之后迅速将其投入液氮中冷冻保存。1.6卵母细胞的孵化培养把装有卵母细胞的冷冻环倒入预先热平衡好的0.25mol/L的蔗糖溶液中,并在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育2～5min,然后将卵母细胞移入0.125mol/L的蔗糖溶液中并在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下再孵育5min,然后用于成熟培养或孤雌激活。1.7卵母细胞的成熟和繁殖具体操作方法同1.3。1.8卵母细胞的单胞激活和培养具体操作方法同1.4。1.9统计分析试验重复3次以上,试验数据用SPSS软件中的χ2进行分析。2结果与分析2.1冷冻组与对照组成熟率和卵裂率比较由表1可知,毒性试验组和冷冻组的形态正常率与对照组相比差异极显著(P<0.01),且解冻成熟培养后冷冻组的成熟率和卵裂率极显著低于对照组(P<0.01);毒性试验组的成熟率与对照组相比差异显著(P<0.05),卵裂率无显著性差异(P>0.05)。2.2对常率、孤成虫卵裂率的影响由表2可知,由于受冷冻保护剂和冻存的影响,毒性试验组和冷冻组的形态正常率与对照组相比差异极显著(P<0.01);而孤雌激活后毒性试验组的卵裂率与对照组相比差异不显著(P>0.05),冷冻组的卵裂率显著低于对照组和毒性试验组(P<0.05);冷冻组和毒性试验组均未发育到囊胚。2.3形态正常率、成熟率和卵裂率由表3可知,冷冻时间为20s和40s时,形态正常率和成熟率及卵裂率均无统计学差异;结果表明,在40s内完成冷冻程序对GV期卵母细胞的形态正常率、成熟率和卵裂率均无影响。2.4态正常率和卵裂率由表4可知,20s和40s在形态正常率和卵裂率均无统计学差异;结果表明,在40s内完成冷冻程序对MⅡ期卵母细胞的形态正常率和卵裂率均无影响。3冷冻保护剂的选择由于常规冷冻操作复杂,耗时长,且需要昂贵的降温设备,使得推广受到一定的限制。因此,大部分研究人员更倾向于利用玻璃化方法研究卵母细胞的冷冻。Vajta等(2006)报道哺乳动物的卵母细胞和胚胎的冷冻保存在将来主要用玻璃化法。Burgos等(2011)研究结果表明,在卵母细胞冷冻中用程序化和玻璃化冷冻对卵母细胞DNA的损伤无显著差异,但对卵母细胞的形态和减数分裂中纺锤体构型的损伤程度是前者显著高于后者。因此,在本研究中直接选用玻璃化冷冻法。冷冻环冷冻法是使含卵母细胞或胚胎的冷冻液直接与液氮接触,且所用冷冻液体积小于1μL,具有冷冻液用量少、冷冻速度快、细胞在冷冻中的成活率高等优点,因此,本试验中采用铜环冷冻卵母细胞,其中铜环的直径为10号针头大小,以便于承载冷冻液和卵母细胞,且使铜环承载的冷冻液较少,从而减少冷冻液对卵母细胞的毒副作用。在冷冻液的筛选中,由于EG、PROH和DMSO等保护剂的化学性质不同,决定了其对细胞的毒性不一样,保护的作用也有所差异(Lim等,1992;Burgos等,2011;陈玉等,2011)。在以前的诸多研究中都单独采用3种溶液作为保护剂来冷冻卵母细胞或胚胎,而近几年的研究都在充分考虑这3种保护剂相结合的优点,从而更进一步提高冷冻效果。Begin等(2003)用20%EG+20%DMSO冷冻剂冻存MⅡ期山羊卵母细胞,解冻后的卵裂率与正常组无显著差异;Gautam等(2008)研究得出用20%EG+20%DMSO保护剂在冷冻水牛卵母细胞中的形态正常率、卵裂率及囊胚率均显著高于其它组。所以,本试验选用20%EG+20%DMSO为冷冻液。本试验中比较研究了冷冻保护剂对云岭黑山羊GV期和MⅡ期卵母细胞冷冻解冻后的形态正常率、成熟率及卵裂率等发育状况的影响。研究结果表明,MⅡ期卵母细胞的冷冻效果明显好于GV期卵母细胞,这与刘海军等(2000)所得结论一致;而MⅡ期卵母细胞的卵裂率与对照组差异显著这一点与Begin等(2003)研究结果不同,这可能是由于培养因素影响所造成的。总之,这些结果表明,山羊MⅡ期卵母细胞更适于冷冻保存,而GV期卵母细胞不适于冷冻保存。其主要原因可能是冷冻损伤了GV期卵母细胞的超微结构(胞质膜、皮质颗粒、线粒体、内质网等),致使解冻复苏后仍难以完成一系列成熟过程所需的形态学和包括蛋白质合成在内的生物化学变化,而冷冻对成熟卵母细胞的超微结构损伤相对较小(孙青原等,1994;Gautam等,2008)。将卵母细胞在冷冻液中平衡处理,然后再放在承载有冷冻液的铜环上。而细胞与玻璃化液接触多长时间,才能保证卵母细胞达到玻璃化而又使玻璃化液对卵母细胞的毒性作用降到最低,很难定论。大部分研究者都习惯采用30s左右的玻璃化时间(Chen等,1986;Eroglu等,1995;Azambuja等,1998;Zhang等,2005)。本试验研究了20s、40s玻璃化时间对冷冻效果的影响,解冻后GV和MⅡ期各组均无显著差异,表明玻璃化时间在40s内均不影响卵母细胞的活力和发育潜力。本研究中,采用玻璃化冷冻体系冻存山羊GV和MⅡ期卵母细胞,虽在形态正常率上获得了较理想的冻存效果。然而,冻存卵母细胞的发育潜力还不是很