铁皮石斛离体培养及植株再生体系的建立

铁皮石斛离体培养及植株再生体系的建立

0发酵铁皮石斛的繁殖与繁殖剥皮属植物，也被称为黑节草，俗称枫豆科。分布于云南、安徽、贵州、浙江、江西、广东和广东。它不仅是珍贵的室盆花，也是珍贵的中药。铁皮石斛的有性繁殖极为困难,其种子极为细小,胚胎发育不完全,无胚乳组织,在自然状态下发芽率极低,苛刻的生长环境,也限制了其有性繁殖。何平荣等研究表明,铁皮石斛平均自然结实率为0.31%。铁皮石斛主要靠根部无性分蘖繁殖而不断生出新的植株并成丛生长,有时也从上部茎节处生根长出新植株。而常规条件下人工繁殖又较难,不能满足日益增长的市场需求,随着人们对它的深入研究与广泛利用,需要大量的石斛作为原料投入药品的研制与生产,因此,研究培养石斛和开发铁皮石斛具有重要的意义,长期以来组织培养在植物生产中得到广泛应用,是产生极大经济效益的一项生物技术。1材料和方法1.1试验材料云南铁皮石斛,取其茎段、叶片作为外植体进行组织培养。1.2测试方法1.2.1反复冲洗法取铁皮石斛茎,去除多余叶片后用解剖刀将茎切成含3～4个节点的茎段,保留节点。清水冲洗3min,用70%的乙醇浸泡10～60s,再转入0.1%的氯化汞中,灭菌5～11min后倒去氯化汞溶液,用无菌水反复漂洗材料3遍以上。用无菌纸吸去茎段上多余水分,将其切成1～2cm带一个芽点的茎段,接种到培养瓶中培养。1.2.2分离的培养基和培养方法铁皮石斛培养基均添加3%蔗糖,0.7%琼脂,pH值为5.8。按不同目的在基本培养基中加入6-BA、NAA、IBA,每个培养瓶分装50m培养基,密封。经过121℃高温灭菌25min。不定芽的诱导培养基是在基本培养基MS中加入细胞分裂素和生长素,采用不用浓度水平的NAA和6-BA。组培苗的壮苗与生根,将生长状态稳定的试管苗接种于添加不同激素组合的1/2MS培养基上。1.2.3培训条件接种铁皮石斛培养材料的组培苗在组织培养室中培养,培养温度为(26±2)℃,光照14h/d,光强1500～2000lx。1.2.4种子培养cm取诱导形成的不定芽,要求芽高2～3cm,带3～5片叶的不定芽,将其接种到不同处理的生根培养基上,进行培养。观察并统计诱导情况,计算生根率。1.2.5培养瓶安装当生根苗培养茎长至3～5cm,根长1～2cm时开始移栽,移栽前将培养瓶开盖放置在组培室中炼苗3～5d。组培苗出瓶时,打开瓶塞将培养基与小苗一起轻轻取出,用流水洗净培养基,将幼苗的根舒展后栽入盛有基质的穴盘中。2结果与分析2.1min消毒时间处理试验结果表明(见表1),11min的处理时间污染率为最低,但死亡率最高为46.7%;9min消毒时间处理效果最佳,污染率较低的同时成活率最高。所以,经使用70%乙醇进行表面灭菌处理30s后,再用0.1%氯化汞溶液消毒9min是最适宜铁皮石斛茎段的消毒方法。2.2培养基的生长情况将消毒处理的茎段接种在以MS为基本培养基,不同激素组合的培养基中(表2),茎段继续生长,接种5～30d后茎段节点处开始长出不定芽(图1)。45d后观察统计不定芽诱导生长情况。从表2可以看出,当在MS基本培养基上添加6-BA和NAA不同激素水平均可以诱导不定芽,但增殖倍数和诱导时间有所差异。1号培养基为没有添加任何激素的MS基本培养基,接种的外植体生长缓慢,没有诱导出不定芽且植株无明显变化。5、6、7、8和10号培养基增殖倍数均低于2倍,2、3和9号培养基增殖倍数均高于2倍,且2号最高为3.1倍。1、4、8和10号培养基的诱导时间均超过了30d,2号培养基的诱导时间最短为5～7d有不定芽点出现,且数目多。从生长情况上看,均生长良好,出现白化及褐化情况极少,但少有叶片黄化的现象。NAA浓度在0.2～0.5mg/L时有根系发生,2和3号培养基中芽根部有少量根系生长。综合分析得到,2号培养基激素组合MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA对不定芽诱导率最高,增殖倍数最高,诱导时间最短,不定芽生长良好,且根系生长量少。2.3叶片诱导无愈伤组织的观察选取铁皮石斛无菌茎段、叶片进行愈伤组织的诱导,接种在MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA培养基上,经过30d后观察记录(表3)。由表3可知,以叶片为外植体进行诱导,无愈伤组织形成,且大部分死亡;在培养基上接种的无菌茎段在茎段基部切口处形成愈伤组织,愈伤组织经过一段时间培养后形成桑果状的原球茎以及具有原球茎与不定芽的组织体(图2)。2.4低浓度naa对组培苗生根的影响将铁皮石斛的不定芽接种至不同处理的生根1/2MS培养基上,45d后观察记录幼苗的生根数及根长(图3、4),结果见表4。NAA和IBA两种生长素均能诱导并促进铁皮石斛组培苗生根。生根率%=(分化出不定根的茎段数/茎段总接种数)×100%。由表4可知,IBA为低浓度0.5mg/L时有利于组培苗的生根,而当浓度升高为2.0mg/L时则明显抑制根的生长,生根率低仅为10%,且根的生长状况不良;当存在低浓度的NAA为0.5mg/L时,生根率最高为96.7%,且平均根长最长2.5cm,浓度升高至2.0mg/L时生根率有所下降仅为60%,根长为0.9cm。综上所述,1/2MS+0.5mg/LNAA的生根率最高,且根的生长情况好,是最适宜的铁皮石斛组培苗生根培养基,其次为1/2MS+0.5mg/LIBA的激素组合培养基。2.5幼苗处理与开栽组培苗一般长至3～4cm高,有3片以上叶和3～5条根时,平均每条根达到1～2cm长,从培养瓶中轻轻取出幼苗,用流水轻轻将附着在根上的琼脂冲洗干净,以免琼脂发霉引起烂根,然后将幼苗的根舒展开栽入盛有基质的穴盘中。为了提高出瓶成活率,在出瓶前把瓶盖全部打开,放置在组培室中炼苗3～5d。移栽到基质中的前2周进行遮光处理,叶面喷水保持湿润勿施肥,可以喷洒抗菌剂防止根部腐烂(图5)。3复杂组培体的诱导和增殖有效地控制污染是植物离体培养成功的关键。培养基和无菌操作方面的污染目前已经得到控制。外植体造成的污染最复杂,也最难控制,其原因可能是由于细引起的,也可能是真菌引起的。微生物可能是腐生的,也可能是内生的,最难处理的则是内生菌。铁皮石斛外植体含有较多的内生真菌,从铁皮石斛根中分离出内生真菌约25种,因此铁皮石斛的外植体消毒应特别注意也较为困难。不定芽诱导和增殖的基本培养基以MS为宜,同时,植物生长调节物质对铁皮石斛的组织培养起重要作用,虽然用量小,但在植物组织培养中使用的激素包括生长素、细胞分裂素等,而NAA和6-BA组合常用于诱导不定芽和生根。结果与其他研究报道的铁皮石斛不定芽诱导培养基配方有所不同,可能与培养的石斛品种有关。同时,适宜的接种密度和不