木聚糖酶产生菌SN01发酵条件优化

木聚糖酶产生菌SN01的发酵条件优化生物工程类1003班，第2组，郑宇璁（南京工业大学生物与制药工程学院，南京210009）关键词：木聚糖酶；发酵条件；DNS法；酶活力；最佳条件摘要：目的：通过对不同培养条件下木聚糖酶产生菌SNO1发酵液催化木聚糖水解产物的测定探究其最佳发酵条件，以便对今后该菌的发酵条件优化提供指导。方法：通过DNS法测定发酵液对同浓度木聚糖催化反应相同时间产生的分解产物，即还原糖的测定，测定，间接体现其酶活力，进而反应SNO1菌在对应生长条件下的生长情况。结论：木聚糖酶产生菌SN01最佳碳源为麦芽糖，最佳氮源为棉酚蛋白，最佳金属离子为4H2O.MnCl2，最低为不加入金属离子。前言：在微生物生命活动中，必须从环境中吸取一些物质，以提供能量，调节新陈代谢并合成细胞物质，这些物质统称营养物质。营养物质是微生物生命活动的物质基础。半纤维素的主要成分是木聚糖，木聚糖（Xylan）是一种多聚五碳糖,是植物半纤维素的重要组分，是自然界中除纤维素外最为丰富的多糖，也是自然界中最为丰富的可再生资源之一，占植物细胞干重的15%～35%。木聚糖主要存在于植物细胞的次生壁中，处于木质素及其他多聚糖之间,起着连接作用，有些植物的初生壁中也有发现。木聚糖的主链由β-D-吡喃木糖残基经β-1，4-糖苷键连接成，依来源不同，可以有不同的侧链取代基，自然界存在的木聚糖形式多样，结构变化非常大，且多为异型多糖。木聚糖酶（[EC]）属水解酶类，是指将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。由于不同来源的木聚糖主链的聚合度、支链残基的种类、数量、长度及其在主链上结合位点的不同，要彻底降解木聚糖需要多种酶共同参与协同。目前已知产木聚糖酶的微生物有几十个属、一百多个种。在海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌和反刍动物瘤胃、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都存在。已报道的能产木聚糖酶的微生物有细菌、链霉菌、曲霉、青霉、木霉等，研究和应用最多的是细菌、曲霉和木霉产的木聚糖酶。多数细菌和真菌分泌胞外木聚糖酶,将木聚糖水解成单糖，再进入微生物细胞供代谢利用。也有一些微生物，如瘤胃细菌、黏液球菌及黑曲霉中的一些种类，也产生胞内酶。木聚糖酶已经在食品、饲料、造纸等众多工业领域充分显示出了它巨大的应用潜力，随着科学技术的发展和研究手段的不断丰富，必然会诞生一大批适合不同应用领域要求的木聚糖酶优良新品种，为解决人类发展中可能遇到的能源、粮食、环境等诸多问题做出巨大的贡献，实现可持续发展。此外，加强木聚糖酶的研究和开发，将有力地推动我国生物技术及其相关产业的发展，具有深远的现实意义。自20世纪60、70年代开始研究木聚糖酶以来，人们越来越发现木聚糖酶具有重要的应用价值，因此人们对其加大了开发研究。目前，国际上对木聚糖酶的研究工作主要集中在对微生物木聚糖酶的诱导、提纯、鉴定及基因的克隆与表达等方面。与国外相比，我国对木聚糖酶的研究起步较晚，主要集中在产木聚糖菌种的筛选和驯化，木聚糖的纯化好理化性质的研究等方面，只克隆了少数木聚糖酶基因。正是由于木聚糖酶的酶学性质决定了其在应用上的潜力即应用领域，目前对于木聚糖酶的研究热点主要有如下几个方面：eq\o\ac(○,1)从天然微生物中筛选性能更为优良的木聚糖酶。eq\o\ac(○,2)加深对木聚糖酶分子作用机理的了解。eq\o\ac(○,3)优化发酵条件，进一步提高木聚糖酶的合成水平。eq\o\ac(○,4)采用基因工程手段改良菌种，已获得更多高产菌株。⑤通过基因工程和蛋白质工程改良木聚糖酶的性质，研制出符合不同应用领域要求的木聚糖酶产品。本研究通过培养就优化的初步研究，以期得到产酶量高的菌株。提高微生物产酶能力是保证酶产品生产的关键1材料与方法1.1实验材料1.12菌种：木聚糖酶产生菌SN011.13生化试剂：碳源：蔗糖、麦芽糖、羧甲基纤维素、微晶纤维素、糊精、甘油（30%水溶液）氮源：硫酸铵、氯化铵、蛋白胨、酵母粉、棉酚蛋白、玉米浆干粉无机盐：无水MgSO4、5H2O·CuSO4、7H2O·ZnSO4、6H2O·NiCl2、4H2O·MnCl2实验耗材：250ml三角瓶：50个；试管：50支；500ml烧杯3个；玻璃棒3支；50ml量筒3个；1ml移液管3支，50μl移液枪3支1.14设备：摇床；分光光度计。1.2实验方法1.21菌种：种子液：对数期的种子液1.22发酵条件对产酶的影响A碳源对产酶的影响基础培养基：蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，按照50ml/250ml分装在六个三角瓶中，在基础培养基内，分别改变碳源种类，其中除甘油外所有碳源的添加量均为5g/L，甘油取0.5mL/瓶。B氮源对产酶的影响基础培养基：甘油10ml/l，氯化钠5g/L，按照50ml/250ml分装在六个三角瓶中。在基础培养基中，分别改变氮源种类，氮源的添加量均为20g/L。C金属离子对产酶的影响基础培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，按照50ml/250ml分装在六个三角瓶中。向基础培养基中加入各种金属离子，添加量为0.2%（m/V），且需要扣除结晶水。【注】另外准备50ml乳糖溶液，浓度为20%，作为诱导剂。将以上所有配好的培养基及乳糖溶液用八层纱布及牛皮纸包扎好后灭菌，条件为121，20分钟。灭菌后取出冷却到室温，将种子液按接种量1ml/瓶接入各个发酵液中，全部接好后，纱布包扎后放入摇床振摇，180r/min，37℃，振摇4个小时后取出，在超净工作台内于无菌条件下往每瓶发酵培养基中加入2ml灭过菌的乳糖溶液，重新包扎好后继续放入摇床中振摇16~20小1.23木聚糖酶活力的测定：（1）DNS法测定还原糖的原理：还原糖是指含自由基或酮基的单糖和某些具有还原性的双糖。它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇到氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。黄色的3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自己被还原为棕红色的3-氨基-5硝基-水杨酸。在一定范围内反应液里棕色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测量吸光度，查出标准曲线并计算，可以求得样品中还原糖的含量。（2）木糖标准曲线的绘制以1mg/ml标准木糖溶液为母液分别用蒸馏水稀释成0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40mg/ml木糖溶液，各取1.0ml至试管，再加入2mlDNS放入沸水中煮沸反应10min，取出迅速放入有自来水的烧杯中冷却至室温,加入7ml蒸馏水，摇匀。用分光光度计在540nm波长下测定各试管中液体吸光值，空白对照试管用来调零。（3）木聚糖活力的测定测定步骤：1.总糖的测定：将发酵液稀释5倍，精确吸取100ul稀释后的发酵液于试管中，加入0.9ml木聚糖底物。2.空白的测定：精确量取1ml蒸馏水，混匀，在70度水浴条件下反应10min，迅速放入盛有自来水的烧杯中冷却至室温，加入2mlDNS溶液，混匀，置于沸水中煮沸10min。迅速放入盛有自来水的烧杯中冷却至室温，加入水7ml使得反应体积为10ml，充分摇匀后在540nm下测量吸光值。以空白对照调零。（4）计算酶活力：酶活力（U/g）=W(mg)*1000*N/(20(min)*0.1(ml))式中：W:酶解反应产生的木糖量，由标准曲线Y=A+B*X得到，1000：将mg转化成μg所乘的系数N：稀释倍数，此处是N=520min:反应时间0.1ml:发酵液体积2结果与分析2.1不同培养条件对于产木聚糖酶SNO1菌的影响2.11碳源的影响表1不同碳源培养条件下发酵液催化反应产物测定碳源蔗糖麦芽糖羧甲基纤维素微晶纤维素糊精甘油OD5400.1360.2160.1080.1150.1140.1162.12氮源的影响表2不同氮源培养条件下发酵液催化反应产物测定氮源硫酸铵氯化铵蛋白胨酵母粉棉酚蛋白玉米浆干粉OD5400.1520.1560.1510.1590.2560.1602.13金属离子的影响表3不同金属离子培养条件下发酵液催化反应产物测定金属离子无水MgSO45H2O·CuSO47H2O·ZnSO46H2O·NiCl24H2O·MnCl2无OD5400.1390.1320.1540.1420.2240.1282.2木糖标准曲线的绘制表4不同浓度木糖吸光值OD5400.1010.2180.3180.4140.5930.6960.823木糖浓度（mg/ml）50.4图1木糖标准曲线2.3酶活力的计算1）不同碳源培养条件下产木聚糖酶菌SNO1酶活力表4碳源OD540木糖量W（mg）酶活力(U/g）蔗糖0.1360.1205301.25麦芽糖0.2160.1533383.25羧甲基纤维素0.1080.1091272.75微晶纤维素0.1150.1119279.75糊精0.1140.1115278.75甘油0.1160.1123280.75图2不同碳源培养条件下产木聚糖菌SN01酶活力2）不同氮源培养条件下产木聚糖酶菌SN01酶活力表5氮源OD540木糖量W（mg）酶活力（U/g）硫酸铵0.1520.1271317.75氯化铵0.1560.1287321.75蛋白胨0.1510.1267316.75酵母粉0.1590.1300325.00棉酚蛋白0.2560.1697424.25玉米浆干粉0.1600.1304326.00图3不同氮源培养条件下产木聚糖菌SN01酶活力3）不同金属离子培养条件下产木聚糖酶菌SNO1酶活力表6金属离子OD540木糖量W（mg）酶活力(U/g）无水MgSO40.1390.1218304.505H2O·CuSO40.1320.1189297.257H2O·ZnSO40.1540.1279319.756H2O·NiCl20.1420.1230307.504H2O·MnCl20.2240.1566391.50无0.1280.1173293.25图4不同金属离子培养条件下产木聚糖菌SN01酶活力2.4结论通过控制变量单因素实验，木聚糖酶产生菌SN01最佳碳源为麦芽糖，其酶活性可达5140.0g，其次为蔗糖、甘油、微晶纤维素、糊精、羧甲基纤维素。最佳氮源为棉酚蛋白，其酶活性可达5965.0g，其次为玉米浆干粉、酵母粉、氯化铵、硫酸铵、蛋白胨。最佳金属离子为4H2O·MnCl2，其活性可达5305.0g，其次为7H2O·ZnSO4、6H2O·NiCl2、无水MgSO4、5H2O·CuSO4，最低为不加入金属离子。参考文献[1]王俊峰，周启扉，刘大伟，刘