分子诊断学：第八章 临床基因扩增检验技术

第八章临床基因扩增检验技术一、A型选择题1．下列哪种不是基因扩增检验技术（D）A．PCRB．LCRC．NASBAD．bDNAE．SDA2．以下基因扩增检验技术中，哪一种属于等温扩增（E）A．PCRB．RT-PCRC．LCRD．HybridcaptureE．NASBA3．能使扩增灵敏度提高的方法是（B）A．多重PCRB．巢式PCRC．原位PCRD．反向PCRE．不对称PCR4．能对未知序列进行扩增的PCR是（D）A．多重PCRB．巢式PCRC．原位PCRD．反向PCRE．不对称PCR5．在定量PCR中，对原始模板准确定量的影响因素中，最大的是（B）A．原始模板的量B．扩增效率C．循环次数D．扩增产物的量E．循环阈值6．外标定量方法最大的缺点是（B）A．不能测定原始模板的绝对量B．测定的重复性和精密性有问题C．标准品制备困难D．不能排除样本间的测定差异E．测定必须在扩增的指数期进行7．最早推出的荧光定量探针是（A）A．TaqMan探针B．相邻探针C．分子信标D．阴阳探针E．端粒探针8．PCR测定中的污染主要是指（D）A．标本间的交叉法治B．环境中的细菌污染C．灰尘污染D．PCR扩增产物的污染E．试剂中的污染物9．UNG防污染预防下列哪种污染（A）A．产物B．靶核酸C．气溶胶D．标本间E．病原微生物10．TaqMan探针采用的是（A）A．荧光标记的探针B．生物素标记的探针C．同位素标记的探针D．SYBRGreen标记引物E．圆形探针X型题选择题1．DNA聚合酶要求下述哪些物质才能进行DNA复制（ABCD）A．dDNAB．Mg2+C．引物D．模板E．小牛血清白蛋白2．核酸扩增抑制物的主要来源是（ABCE）A．血清中的血红素B．尿标本是的尿素C．核酸提取中的有机溶剂D．Mg2+E．部分抗凝剂3．临床基因扩增中，弱阳性室内质控样本发生失控，其原因可能是（ABDE）A．核酸提取中的丢失B．标本中扩增抑制物残留C．扩增仪孔间温度不均一D．Taq酶和/或逆转录酶失后E．扩增产物污染二、名词解释1．聚合酶链反应2．原位PCR3．RT-PCR4．反向PCR5．多重PCR6．巢式PCR7．不对称PCR8．锚定PCR9．荧光定量PCR10．循环阈值11．TaqMan探针12．分子信标13．LCR三、问答题1．影响PCR反应的因素有哪些？2．试证明Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比。3．简述bDNA信号放大系统的原理。4．PCR检测技术有何临床应用。5．临床基因扩增检验实验室应如何设置。6．如何保证临床基因扩增检验实验室的质量。参考答案一、A型选择题1．D2．E3．B4．D5．B6．B7．A8．D9．A10．AX型题：1．ABCD2．ABCE3．ABDE二、名词解释1．聚合酶链反应：PCR是利用DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）等在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片断合成的基因体外扩增技术。由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成。2．原位PCR：是指直接用细胞涂片或石蜡片包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。3．RT-PCR：逆转录PCR是一种检测RNA的方法。其原理是先在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板合成互补的cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应。4．反向PCR：是对已知DNA片断两侧的未知序列进行扩增和研究的一种方法。其原理是：用限制性内切酶消化DNA片断，然后用连接酶将酶切产物连接成环状，再用已知序列上两端相反方向的引物进行PCR。5．多重PCR：是在一次反应中加入多种引物，同时扩增一份DNA样品中的不同序列。每对引物所扩增的产物序列长短不一。根据不同长短的序列存在与否，检测是否有某些基因片断的缺失与突变。多重PCR对于检测疾病相关基因十分庞大的疾病很有价值。6．巢式PCR：巢式PCR有两对引物，一对引物对应的序列在模板外测，称外引物，另一对引物互补序列在同一模板的外引物的内侧，称内引物，即外引物扩增产物较长，含有内引物扩增的靶序列，经过二次PCR放大将单拷贝的目的DNA序列检出。巢式PCR最大的优点是灵敏度大大提高7．不对称PCR：不对称PCR的目的是扩增产生特异长度的单链DNA。PCR反应中采用两种不同浓度的引物，一般采用50～100：1比例，最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA，但当低浓度的引物被消耗尽后，以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物，结果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用二种引物浓度不同，因此称为不对称PCR。8．锚定PCR：锚定主要用于扩增未知序列或未全知的序列。首先分离总RNA或mRNA，在逆转录酶作用下合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA的3′端上加上poly(dG)尾，与此poly(dG)相对应的锚定引物为poly(dC)，为保证扩增特异性，poly(dC)应在十二聚以上，5′端还可带上某些限制性酶序列或其他序列信息。9．荧光定量PCR：荧光定量PCR亦称实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号检测整个PCR过程，获得在线描述PCR过程的动力学曲线，最后通过标准曲线对未知模板核酸进行定量分析的方法。10．循环阈值：循环阈值是在PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比。11．TaqMan探针：在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团，如FAM、VIC等，3′端标有荧光淬灭基团，如TAMRA等。当探针完整时，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收从而产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。12．分子信标：分子信标探针是TaqMan探针的一种衍生方法。探针设计与TaqMan探针相似，只不过是探针5′和3′端的一小段核苷酸序列被设计成互补的，没有与靶序列杂交时会形成发夹状态，此时荧光基团和淬灭基团极端靠近，荧光几乎完全淬灭。探针与靶序列杂交后，发夹展开，荧光基团与淬灭基团分开，荧光得以恢复，荧光检测系统即可接收到荧光基团的荧光信号13．LCR：连接酶链反应又称为连接酶扩增反应。LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5′磷酸与另一相邻链的3′羟基连接为基础的循环反应。LCR扩增对象不是目标片段，而是由引物组成的探针，是一种探针扩增技术。LCR需要两对引物A、B和A′、B′，其中引物A与引物A′互补，引物B与引物B′互补。模板双链DNA经加热变性后，两对引物分别与模板链复性退火，复性后引物A和B′的3′端分别与引物B和A′的5′端相邻。若引物与模板完全互补，在DNA连接酶的作用下，使得相邻两个引物A和B、A′和B′的5′磷酸与3′羟基形成磷酸二酯键而相连。连接产物变性后，又可作为引物的模板参加反应，使扩增呈指数增长，经过变性-复性（退火）-连接的20～30个循环，检测连接反应的产物。三、问答题1．影响PCR反应的因素有哪些？PCR反应体系包含DNA模板、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、dNTP及含有必需离子的反应缓冲液，这些因素都对PCR反应产生影响。2．试证明Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比。一般来说，第n次PCR循环的荧光信号强度（Rn）等于背景信号强度（RB）加上每个分子的荧光强度（即单位荧光强度RS与分子数目的乘积），用数学式表示如下：Rn=RB+XO（1+Ex）nRs式中：Rn代表荧光信号强度RB代表背景信号强度Xo代表起始模板拷贝数Ex代表扩增效率Rs代表单位荧光强度N代表循环次数当循环次数n=Ct时，则RT=RB+Xo（1+Ex）CtRs两边取对数，则lg（RT-RB）=lgXo+Ctlg（1+Ex）+lgRs将其整理，则，+Ct=lgXolg(RT-RB)-lgRs+Ct=lg(1+Ex)lg(1+Ex)对每一个特定的PCR反应来说,Ex、RT、RB、和Rs都是常数，所发Ct值与lgXo成反比，也就是说，Ct值与起始模板DNA的拷贝数（Xo）的对数成反比，起始DNA浓度每增一倍，Ct值减小一个循环。因此，Ct值的引入确保了实时荧光PCR定量的精确和严格。3．简述bDNA信号放大系统的原理。分枝DNA是人工合成的带有侧链的DNA片段，在每个侧链上都可以标记可被激发的标记物。以bDNA为基础建立的连续放大DNA信号以检测DNA的技术称为分枝DNA信号放大系统。bDNA信号放大系统包括四种杂交探针，即目标探针、前放大体、放大体和标记探针。首先用亲和素包被微孔，加入目标探针，该组探针能与等检核酸靶序列上不同区域互补，其5′端用生物素标记，能与微孔中的亲和素高度亲和结合；再向微孔中加入待测标本，目标核酸与固定于微孔中的目标探针结合；再加入前放大体，该组探针的一段能与目标核酸的不同区域互补结合，另一段与放大体（即分枝DNA）的主链部分的序列互补结合，分枝DNA由主链和数十根寡核苷酸组成，每个分枝上都有标记探针的杂交位点，由酶标寡核苷酸组成的标记探针与bDNA上的互补序列结合，加入底物后最后经化学发光检测仪检测。利用bDNA信号放大系统可在每个靶序列上结合60～300个酶分子，而且所有杂交反应同时进行，观察到的信号与靶DNA的量成正比，可通过标准曲线将靶DNA定量。4．PCR检测技术有何临床应用。（1）PCR在病原微生物的检测中的应用；（2）PCR在遗传病中的应用；（3）PCR在肿瘤中的应用；（4）其它方面的应用：PCR技术除用于临床诊断和治疗外，还可用于DNA指纹、个体识别、亲子关系识别、法医物证等。5．临床基因扩增检验实验室应如何设置。由于基因扩增检验是对靶核酸的指数倍扩增过程，因而有大量的扩增产物的出现，这种扩增产物极易对以后的新扩增反应产生“污染”，为防止这种污染的发生，就需要对基因扩增检验实验室进行严格的分区。临床基因扩增检验实验室原则上分为四个分隔开的工作区域，即试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区以及扩增产物分析区。如果采用全自动扩增仪，后两个区域可以合并。应注意的是，各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。进入各工作区域必须严格按单一方向进行，即试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。各区的仪器设备包括工作服、鞋子、实验记录本