不同组合的冷冻保护剂对小鼠卵巢组织的影响

不同组合的冷冻保护剂对小鼠卵巢组织的影响

随着医学水平的快速发展，肿瘤患者的长期生存率显著提高，但大剂量放射化疗对患者的内经功能和生育能力产生了严重影响。卵巢组织冷冻保存是一种较理想的卵巢功能保存方法。目前常用的冷冻方法是程序化冷冻,但它需要昂贵仪器,费时,消耗液氮多。而玻璃化冷冻是一种简单、高效、快速的冷冻方法。在超低温条件下,高浓度的玻璃化冷冻液渗入到细胞内部,使之处于玻璃化状态而不形成冰晶,因此对细胞的损伤较小。1985年Rall等首先使用玻璃化冷冻法进行鼠类胚胎的冷冻,此后在较多方面得到应用,包括动物及人类胚胎、卵子、人类干细胞和卵巢皮质组织等。但目前尚无公认的、统一的标准最佳玻璃化溶液配方。卵巢组织结构不同于胚胎和囊胚,有特定的空间立体结构,多种类型细胞,细胞密度高,有一套血管系统,因此适合卵巢组织玻璃化冷冻的冷冻保护剂配方需进一步探讨。本研究利用不同组合的冷冻保护剂,观察比较玻璃化冻融小鼠卵巢组织的形态学改变,探索出适合冷冻卵巢组织的理想的玻璃化冷冻保护剂组合,为玻璃化冷冻保存人类卵巢组织的研究奠定基础。材料和方法一、材料表面1.实验动物选取清洁级的昆明小鼠20只,2w龄,体重为10g。由上海交大医学院动物房提供,饲养条件符合国家实验动物的饲料标准。2.胎牛和血清试剂乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMSO)、改良磷酸缓冲液(DPBS)、丙二醇(PROH)和蔗糖购自美国Sigma公司。胎牛血清购自杭州四季清公司。塑料麦管购自法国IMV公司。二、实验方法1.玻璃冷冻(1)皮肤组织病理学观察将20只昆明小鼠随机分为4组,每组5只,用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(50mg/kg),常规消毒后,分别在两侧肋脊角处剪开皮肤及肌肉,暴露卵巢,在解剖显微镜下剪开卵巢囊,完整剪下双侧卵巢。用DPBS液清洗卵巢3次,然后剪成(1mm×1mm×1mm)的组织块,用于冷冻保存。(2)复配液冷冻液和解冻液均采用含10%胎牛血清的DPBS作为基础液。冷冻保护液分为3组:A组20%EG(v/v)+20%DMSO(v/v)+0.5mol/L蔗糖。B组20%EG(v/v)+20%PROH(v/v)+0.5mol/L蔗糖。C组20%PROH(v/v)+10%DMSO(v/v)+0.5mol/蔗糖。冷冻预平衡液为渗透性冷冻保护剂浓度的1/2+DPBS(含10%胎牛血清)。解冻液a、b、c分别为0.5、0.25、0.125mol/L蔗糖+基础液。(3)麦管和麦管的渗透先将卵巢组织块移入预平衡液中,4℃渗透平衡15min,再移入冷冻液,继续渗透平衡,5min内装入麦管,每根麦管有2个卵巢组织,然后直接投入液氮中保存。(4)组织块的处理冷存一周后,从液氮罐中取出麦管,置空气中停留30秒,迅速放入30℃水浴锅中解冻,冷冻液融化后,将卵巢组织块依此移入解冻液a、b、c中,每次置室温10min,然后用基础液漂洗卵巢2次,每次5min,最后将组织块放入盛有TCM199培养液(美国Sigma公司)的培养皿中,在37℃二氧化碳培养箱培养6h后固定。2.形态正常与卵母细胞形态表现将部分新鲜和复苏的卵巢组织制成切片,HE染色,光镜下观察卵泡、卵母细胞和颗粒细胞的形态和结构。形态正常的卵泡表现为卵泡与卵母细胞呈圆形,颗粒细胞分布均匀,基底膜完整。如果卵泡与卵母细胞形态不规则;卵母细胞与卵泡细胞之间出现空隙,或与基膜分离;卵母细胞出现核浓缩;颗粒细胞形态异常,分布不均匀,为异常卵泡。每组随机选择5张切片,分别计数正常卵泡和异常卵泡,图1见封三。3.tdt转换染色将各组卵巢组织石蜡切片用TUNEL方法染色,观察卵泡内卵母细胞和颗粒细胞凋亡情况。切片常规脱蜡和水化,以蛋白酶K消化后,用0.3%H2O2阻断内源性过氧化物酶的活性,然后加荧光素标记的核苷酸和脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)混合液,37℃孵育60min。加POD转换剂后,DAB室温避光显色,苏木精复染后封片。TdT缓冲液代替TdT酶作为阴性对照。卵母细胞核内出现棕黄色颗粒视为卵母细胞凋亡的卵泡;≥2个颗粒细胞核内出现棕黄色颗粒为颗粒细胞凋亡的卵泡。4.免疫总苏-四氧化学体3.2测定Bcl-2和Bax蛋白(一抗稀释1∶200)表达免疫组化试剂盒(S-P法)由武汉博士德公司制造。将卵巢切片(4μm)贴到多聚赖氨酸处理的载玻片上,60℃烘烤4h。切片常规脱蜡和水化,然后放入枸橼酸钠修复液中,置微波炉抗原修复10min,冷却,PBC洗5min×3。随后按照试剂盒说明书进行操作:(1)3%H2O2室温处理10min,PBS洗5min×3;(2)正常山羊血清湿盒内37℃封闭10min,PBS洗5min×3;(3)加一抗孵育4℃过夜;(4)甩去一抗,加生物素标记二抗室温孵育10min,PBS洗5min×3;(5)链霉素-过氧化物酶室温孵育15min,PBS洗5min×3;(6)DAB染色3-10min。所有切片以苏木素复染,光镜下观察。以缓冲液代替一抗作为阴性对照组。光镜下(×200)观察卵细胞和/或颗粒细胞的胞浆内出现棕色视为Bcl-2和/或Bax蛋白表达阳性,每个标本取3张切片,每张切片随机取10个视野,计数阳性细胞数量,分别计算Bcl-2和Bax蛋白表达率。5.统计处理采用SAS统计分析软件分析数据。结果1.正常率和初级泡水质的比较表1光镜观察发现各实验组的各级卵泡形态正常率均明显低于对照组,B组的始基卵泡形态正常率和初级卵泡形态正常率高于A组和C组,差异有统计学意义(P<0.05)。各组卵泡分类及比例和异常卵泡数见表1。2.冻融后不同时间前卵母细胞凋亡率和颗粒细胞率TUNEL阳性染色为棕黄色颗粒,位于细胞核内(图2见封三)。各组冻融后卵泡凋亡率、卵母细胞凋亡率和颗粒细胞率均高于对照组,有统计学差异;A组和C组冻融后卵泡凋亡率、卵母细胞凋亡率和颗粒细胞凋亡率高于B组,有统计学差异(P<0.05)。各组卵泡凋亡率、卵母细胞凋亡率和颗粒细胞凋亡率情况间表2。3.冷冻前后bax蛋白阳性表达率比较Bcl-2蛋白和Bax蛋白在各生长期的卵泡中不同程度表达。各级卵泡内的卵母细胞或颗粒细胞胞浆呈棕黄色为蛋白表达阳性(图3封三)。3种方法冷冻后卵泡内Bcl-2蛋白阳性表达率均显著低于新鲜组(P<0.01)。B组卵泡Bax蛋白阳性表达率最低,与A组和C组相比具有统计学意义,而各实验组的卵泡内Bcl-2蛋白阳性表达率均显著低于新鲜组(P<0.01)。B组Bcl-2蛋白阳性表达率最高,与A组和C组相比具有统计学意义。3种方法冷冻后卵泡内Bax蛋白阳性表达率均显著高于新鲜组(P<0.01)。各组卵泡Bcl-2,Bax蛋白阳性表达率情况见表3。不同冷冻保护剂组合对卵组织保护剂最佳配方的筛选冷冻保存卵巢组织可为因恶性肿瘤治疗而将导致卵巢功能不全或丧失的女性提供生育和内分泌功能保存的可能性,与冻存卵子或胚胎相比,冷冻保存卵巢组织有着许多优势。目前慢速冷冻方法已比较成熟,在许多研究领域已广泛应用。玻璃化冷冻技术作为一项经济、简便和高效的冷冻技术在卵巢冷冻研究领域内应用日渐增多,玻璃化冷冻与慢速冷冻的主要差别包括冷冻速率和冷冻保护剂的使用。玻璃化冷冻通过高浓度冷冻保护剂的使用,在快速降温中(常常会超过1500℃/min)能形成一种玻璃化状的固体,使胞浆内外的水物质迅速通过-5至-15℃的冷冻敏感区,避免了胞浆内冰晶的形成。要发展卵巢组织的冷冻技术,其关键之一是冷冻保护剂的选择。常用的渗透性冷冻保护液包括EG(乙二醇)、PROH(丙二醇)和DMSO(二甲基亚砜)。卵巢组织结构不同于胚胎和囊胚,它有特定的空间立体结构,多种类型细胞,细胞密度高和一套血管系统,进行玻璃化冷冻时需要更高的浓度或/和更长的平衡时间,已有研究证明联合应用两种或以上冷冻保护剂冻存卵巢组织能够降低毒性和增强冷冻效果。虽然已有玻璃化冷冻保存卵巢组织的文献报道,但到目前为止还没有公认的适合卵巢组织玻璃化冷冻的最佳保护剂配方。因此本实验通过比较不同组合的保护剂配方的效果,试图筛选出效果最佳的保护剂组合,为临床应用提供理论依据和实验基础。本实验发现,所有上述冷冻方法均使卵巢组织始基卵泡、初级卵泡和次级卵泡的形态正常率较新鲜组织明显下降,说明每种冷冻方法均对卵巢组织中各级卵泡造成一定程度的损害。在3种冷冻方法中,B组始基卵泡形态正常率最高,与A组和C组相比具有显著性差异。Newton研究发现,在4℃,PROH对人类卵巢组织的渗透力弱于DMSO和EG,而在37℃,PROH在卵巢组织的扩散能力强于DMSO和EG。本研究的冷冻方案是在室温下进行平衡,因而PROH对卵巢组织的渗透力大于DMSO,并且PROH对细胞的毒性小于DMSO。而EG分子量小,易穿透细胞膜,与其它冷冻保护剂联合应用,可增强效果,弥补其玻璃化形成作用较差的缺点。因此相比与其它组合,PROH联合EG更能够互补优势,增强冷冻保护作用,这可能是PROH与EG组合强于其它组合的原因。有研究发现冻融能诱发卵巢组织中的细胞凋亡,尤其是颗粒细胞,因此卵泡凋亡程度的大小可作为卵巢冻存后损伤程度的检测方法,本研究发现各组玻璃化冻存后卵巢组织内卵泡凋亡率、卵母细胞凋亡率和颗粒细胞率均高于对照组,有统计学差异。研究还发现B组卵巢组织内卵泡凋亡率、卵母细胞凋亡率和颗粒细胞率明显低于A组和C组。这一结果支持EG和PROH的组合优于其它组合的推论。Bcl-2蛋白家族参与凋亡的调节,Bax参与促细胞凋亡的调节,而Bcl-2抑制细胞凋亡的发生,Bcl-2与Bax的比值决定细胞的命运。本实验通过检测凋亡相关蛋白的表达水平来衡量各方案的效果。结果发现在各实验组中,B组卵泡的Bax蛋白阳性表达率最低,与A组和C组相比,差距具有统计学意义。而B组卵泡的Bcl-2蛋白阳性表达率最高,与A组和C组相比具有显著性差异。结果提示:B组中的卵泡细胞及颗粒细胞凋亡程度低于A组和C组。由此可以推断:与A组和C组相比,B组更好地保护卵巢组织,这与以上观察结果相一致,同时发现凋亡相关蛋白的表达水平可以作为来衡量各方案的效果的指标。冻存和融解过程中细胞损伤的机制可能是细胞内冰晶的破坏和保护剂的毒性作用导致一系列凋亡相关蛋白表