植物组织培养中的几个常见难题

植物组织培养中的几个常见难题

在组织培训过程中，植物存在一些常见问题，如微生物污染、棕榈树（黑）变、玻璃化等。近年来，植物组织培养技术发展迅速，相关问题的研究日益深入。根据国内外最新研究成果和作者在集体培训试验研究中遇到的具体情况，本文简要介绍了这些问题的原因和控制方法。结合自己多年的实践经验，提出了一些问题的解决方案和思路供相关人员参考。1微生物污染1.1其他细菌引起的污染植物组织培养中的污染,主要来自两方面:一是植物材料本身带菌;二是操作者及空气中所带微生物所致.另外,污染还可能由于培养基带菌,操作用具带菌的交叉污染所致.污染的微生物分为细菌及真菌两大类.细菌污染的特点是:菌斑呈粘液状,而且在接种后2~3d即可发现.主要是工作人员使用了未经充分消毒的工具(镊子、剪刀、烧杯、培养皿等)及呼吸时排出的细菌所引起的.有时也因操作人员用手接触材料或器皿边缘,这也增加了微生物落入材料或器皿的机会.还应特别注意避免交叉污染,如,已灭菌的接种工具被消毒不够彻底的超净工作台面污染后又污染消毒过的材料和已灭菌的培养基等.真菌污染的特点:一般多由接种室(箱)的空气污染造成.形成的原因,一是接种室的空气本身未经很好消毒,二是操作时由于打开瓶盖时真菌孢子落入瓶内,或在去掉包头纸及解除捆扎包头纸的橡皮筋时,扬起了真菌孢子,致使接种室空间污染.需要指出的是,要特别注意潜伏性内生菌的污染,这是往往被操作者所忽视的问题.在植物体中除了根尖和茎尖的顶端分生组织以外可以认为其他部位都是有菌的,只是程度不一样而已.特别是维管系统中带菌的机会最大,但是在培养的初期往往不会表现出来,只是到了外植体坏死的时候突然在外植体表面出现了污染,这种情况就属于潜伏性污染.因为在培养的初期,细胞的生命力比较旺盛,即使组织中有菌潜伏,但是由于细胞本身的防御系统(包括膜系统、酶系统和细胞分裂等),微生物不能侵入到细胞里面,所以看不出来,当培养到一定阶段,由于各种环境因素的变化,比如培养基严重失水,或者其他原因等,潜伏性污染便会表现出来.1.2消毒和除草在组织培养的各个环节中要严格按照无菌操作的要求,操作者心里的无菌概念要非常清晰,要明确什么是消毒?什么是灭菌?前者是指不彻底的杀菌,后者是指彻底的杀菌.只有通过高压蒸汽灭菌、火焰灼烧和升汞等消毒剂彻底处理过的物品器械才能认为是无菌的,否则都必须认为是有菌的.要尽量减少和杜绝杂菌的存在,才可能最大限度避免交叉污染的发生.现在常用的方法有:(1)外植体的灭菌要彻底.要获得完全无菌的接种材料,可从两方面入手:选取植物组织内部无菌的材料和通过消毒处理杀死材料表面所存在的各种微生物,根据不同材料选用不同的消毒剂及其合适的浓度和处理时间,运用不同的消毒方法.常用的消毒剂有:5~10%漂白粉、70~75%酒精、0.1~0.2%升汞及2~10%次氯酸钠.对于有茸毛、粗糙不平的地下部分等难消毒的材料,消毒前一般用70%酒精浸泡数秒到数十秒或在消毒剂中加数滴吐温-80,以达到有效消毒的目的.外植体的消毒要非常细心,比如茎段消毒,经过消毒剂处理后,要把两端切去约0.5cm,这样可大大减少污染概率.还有,在消毒后最好把外植体分成三份分别置于不同的无菌的培养皿中,这样可以减少交叉污染的概率.在消毒过程中,要使所有的外植体都要充分接触药剂,不能暴露于液面否则造成交叉污染.(2)严格遵守无菌操作规程.工作人员在操作过程中必须严格遵守以下无菌操作规程,才能尽可能减少或避免培养材料和培养基的污染.操作人员在进入接种室前洗手,换上消毒过的工作服、鞋帽和口罩;操作前用70%酒精擦洗双手,操作中也经常用酒精擦手;每次操作都要灼烧用具(镊子、剪刀、接种针等).要特别强调的是,酒精擦过的表面和消毒液处理过的材料不可能完全没有菌,只是菌的数量大大减少了,只有经过酒精灯灼烧过的和高压蒸汽灭菌过的物品才可以认为是无菌的,还有在超净工作台中要充分利用酒精灯的作用,这样可以大大减少污染.操作时一定要细心,心里要很明白哪些动作很可能会染菌.(3)加入抗生素.培养基中加入适当的抗生素,可有效防止污染,常用的抗菌素有青霉素、链霉素、土霉素等,用量在5~20mg/L.(4)无菌培养.外植体经过消毒灭菌后,接种于灭菌过的培养基中,即进入无菌培养的环节.培养室内需清洁少菌,可在室内装紫外灯,定期开灯灭菌,还可用高锰酸钾和甲醛混合液定期熏蒸,或者用75%酒精喷雾.(5)控制外植体的接种数量.外植体第一次接种时要用小容器,一个容器只接一个外植体,不能接多,因为按照污染的概率计算,接种的数量越大,污染的概率就越大.(6)转瓶继代培养.根据笔者的经验,如果一旦发现已经有了污染的苗头,最好马上转接到新的培养基上,如果没有时间,可以暂时把整个培养容器放入冰箱中4℃保存,第二天再做,这样可以抑制微生物的生长.这样做虽然比较麻烦,但是却可以拯救一些珍贵的而稀少的培养材料(外植体),因为在污染的早期,孢子还没出现,这时候转接污染的机会相对减少.但是即使这样做也不能保证完全不污染,最好在转接时把外植体用75%的酒精消毒0.5min,这样比较保险些.通过这样的办法可以拯救了不少珍贵的材料,如果一发现污染就把整个容器的材料丢弃,这样太可惜了,当然材料很充分的时候是没有关系的,但是对于一些珍稀的材料则应该想方设法加以拯救为宜.2外植体和受影响组织的褐化2.1影响棕榈树的因素2.1.1选择容易褐变的植物外植体材料的基因型不同,褐变程度也不同.比如大多数块茎、鳞茎(如马铃薯、百合、水仙等)、天南星科植物(魔芋、芋头等)、松柏科植物(红豆杉、松、柏等)、茶科植物(山茶、油茶等)、木兰科植物(荷花玉兰、白兰等)很容易褐化,而蔷薇科植物(玫瑰、月季等)、金缕梅科植物(红花继木等)、木犀科(桂花等)不容易褐化,容易的褐化的植物多于不容易褐化的植物.因此,对于易褐变的植物,在组培中应注意筛选褐变程度轻的材料作为外植体.但是有一点需要说明的是,虽然有些植物容易褐化,但是并不影响丛生芽或者愈伤组织的诱导,比如在接种菊花的茎段时,虽然茎段已经褐化,但是休眠芽却能够顺利被诱导出来或者能够出现愈伤组织,在这种情况下可以不考虑褐化问题.只有在褐化严重影响了愈伤组织或者芽的诱导的情况下才要采取措施抑制褐化的出现.褐化严重时就会转为黑化,组织坏死.2.1.2幼芽作、褐化及褐变的特点材料本身的生理状态不同,接种后褐变的程度也不同,其原因可能是不同生理状态的材料,酚类物质的含量及PPO活性都不同.邱璐等用桑树基部发出的幼芽作外植体比用桑树上部高大枝条上的壮芽作外植体褐化轻,褐化率低,幼龄树比老龄树褐化轻、褐化率低.一般而言,用分生部位作外植体接种后形成的醌类物质少,褐变轻,而分化部位作外植体后形成的醌类物质多,因此容易褐变.这与分生组织生长速度快、细胞分裂频率高有一定关系.另外,外植体中致褐物质的含量也因季节的不同而不同,冬季褐变少,夏秋季褐变最严重,存活率最低.2.1.3培养基产品2.1.3.降低单一培养基的带来的褐化反应过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体的褐变,如柚棕用MS无机盐培养基易引起外植体的褐变,而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变,而且可以获得愈伤组织和胚状体.张寒霜等在研究低酚陆地棉胚发生过程中发现,培养基成分中KNO3加倍时易使继代愈伤发生褐化.邱璐等在云桑组织培养中也发现,使用1/2MS培养基,降低无机盐浓度,能有效减轻褐化现象,降低褐化率.2.1.3.ba的浓度和浓度对促进细胞悬浮的效果细胞分裂素(6-苄基氨基嘌呤或激动素)有刺激多酚氧化酶活性提高的作用.在桑组织培养过程中BA的使用浓度低、褐化轻,随BA浓度的提高,其褐化率升高.王异星等在荔枝的细胞悬浮培养中采用1mg/L6-BA+2mg/L2,4-D的配比,培养细胞生长较1mg/L6-BA+1mg/L2,4-D增殖快而不易褐变,说明选择最佳的生长调节剂使外植体快速生长,提高分化量,是克服褐变的有效措施.2.1.4培养基硬度对褐变的影响愈伤组织增殖继代方法影响着褐变.如低酚陆地棉愈伤组织继代培养时,如果将愈伤组织及其下胚轴一起转移到继代培养基上,它可以保持活力继续增殖生长,但如果将愈伤组织切离外植体后转接,则易出现褐化,且14d后才能再生出新鲜的愈伤组织.接种或继代后培养时间过长,未及时转移,也会引起材料的褐变,甚至导致全部死亡,这在培养过程中是经常可见的.培养基硬度对褐变也有影响.在云桑的组织培养中,琼脂用量大,培养基硬度大,则褐变率低;随着琼脂用量的减少,培养基硬度减小,组织褐变加重.此外,培养条件不适宜,如温度过高或光照过强,均可使多酚氧化酶的活性提高,从而加速被培养组织的褐变.因此,在培养初期一般都采用遮光并保持较低的温度(20℃左右),可以减轻褐变的发生.2.2防止棕榈树2.2.1外植体及植物基因型的筛选处于旺盛生长状态的外植体,具有较强的分生能力,其褐变程度低,为组培之首选.DanhuYu和CaroleP认为生长在避阴处的外植体比生长在全光下的外植体褐变率低,腋生枝上的顶芽比其他部位枝的顶芽褐变率低.对于容易褐变的植物则应注意对其不同品系基因型进行筛选,以采用褐变程度轻的材料来进行培养为佳.2.2.2活性炭对培养基外植体的活性在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用,使其重新还原为酚.但是其作用过程均为消耗性的,在实际应用中应注意添加量,其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用在生产应用中可不受限制.加入活性炭(0.1~1%)可以吸附培养基中的有害物质,包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等,从而有利于培养物的生长.但是要注意的是,活性炭同时也可以吸收培养基中的激素等成分而使之降低浓度.2.2.3外植体的接种何琼英等在苦丁茶体细胞组织培养前,将苦丁茶茎段经常规消毒后用可溶性聚乙烯毗咯烷酮(PVP2g/L预处理,浸泡l0~15min,并在培养基中加入1g/L的活性炭,获得较好的防褐效果.用抗氧化剂溶液进行预处理,或在抗氧化剂溶液中切割剥离外植体,或在接种之前用无菌水反复清洗外植体,洗尽切口处渗出的酚类物质,均可起到减轻褐变伤害的作用.根据笔者的经验,把姜花、茶花等易褐变的外植体接种前放入冰箱(4℃)中两天再取出接种后置于15~20℃中培养可以大大降低褐化程度,或者是在接种时用1~2%的盐水处理1min外植体也可以有效降低褐化.2.2.4控制好早期培养的温度在培养时选择适当的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平以及pH值对于防止褐变的发生是十分重要的对于易褐变的材料,初期培养时在黑暗下进行,并保持较低温度(15~20℃),可降低PPO活性,防止酚类物质氧化,因而能减轻褐变的发生.可以说在所有影响褐化的因素中温度是最重要的,笔者在多年的组培实践中发现容易褐化的材料在夏天无法进行,但是到了秋冬季则褐化的程度大大降低.2.2.5抗褐剂的制备对于易褐变的材料,在培养初期进行连续转移,可以减轻由于醌类物质的积累对培养物的毒害.1mmol/L的NaCl在抑制荔枝多酚氧化酶活性的同时,还可促进细胞体积的增加,而且它对人体无毒,来源广,价格低廉,是一种有应用价值的防褐剂.在培养基中加入50mmol/L的蜂王浆在促进组织增殖生长的同时,也有一定的防褐作用.另外,在荔枝细胞悬浮培养过程中,加入50mmol/LAgNO3或5mmol/LVC均可部分抑制PPO活性,防止细胞褐变发生.3玻璃制造3.1影响观赏植物试管苗玻璃化的因素3.1.1容易玻璃化的品种不同品种及同一植物的不同外植体部位对试管苗玻璃化有显著影响.张翠玉等报道,不同品种植物玻璃苗的发生频率有较大差异,一类是容易玻璃化的品种,如香蕉、草本花卉;一类是较易玻璃化的品种,如红檵木、马铃薯等;一类是不易玻璃化的品种,如松柏科植物、桑科植物格林姣红.这种差异可能与各个品种内源激素水平不同有关.周菊华等观察瑞香当年生嫩枝的芽、中部茎段和基部茎段3种外植体结果表明,用基部茎段作外植体时无玻璃苗,中部茎段的玻璃苗可高达75%,芽则介于基部和中部茎段之间.3.1.2光照强度对玻璃苗发生的影响试管苗培养过程中,光照、温度、湿度、pH值均间接影响着玻璃化的发生.肖玉兰等研究发现,光照强度在10000~20000Lx范围内,随着光照强度提高,玻璃苗显著减少.培养温度相对降低或用40℃热激处理,pH值7.0培养,均可消除玻璃化现象.相对湿度降低也可有效防止玻璃苗发生.3.1.3培养基元素含量的影响研究表明,MS培养基是控制玻璃化发生的较理想的培养基.培养基中增加K、P、Fe、Cu、Mn、Zn元素的含量,降低B含量,增加硝态氮,降低铵态氮,均可避免玻璃苗发生.3.1.3.琼脂糖凝固剂和湿地松脂糖凝固剂的影响琼脂作为一种中性支撑物,在植物组培中已成为公认的事实.但许多研究表明,琼脂是形成玻璃苗的重要影响因素.戴桂林等发现,由于琼脂中N、Mg、Mn、Fe、B、Zn等含量的差异,导致玻璃苗发生率明显不同.可见,并不是琼脂的物理性质,而是其化学组成在影响玻璃苗发生.张燕玲等报道,琼脂浓度与玻璃苗发生率呈极显著负相关(r=-0.982),说明提高琼脂浓度是控制玻璃化的有效途径.但琼脂作为培养基的主要凝固剂,其浓度过高,会大大降低试管苗的繁殖系数,且生长缓慢.3.1.3.激素对玻璃苗的影响在离体培养中,碳源的种类和含量对试管苗的玻璃化也有较大影响.Zimmerman等报道,接牵牛玻璃苗叶片的还原糖含量明显较高,而肌醇含量则较低.另据郭达初等报道,用相同含量的葡萄糖替换蔗糖会增加香石竹嫩梢培养物的玻璃苗率.李云等在珠美海棠中也观察到了同样的现象,但认为葡萄糖和蔗糖对试管苗的影响未达到显著水平.张燕玲等研究表明,糖含量与丝石竹玻璃苗率呈极显著负相关,在含糖20g/L的培养基中,玻璃苗率为100%,含糖60g/L的培养基,玻璃苗率则降至70%.培养基中的细胞分裂素易导致玻璃苗产生.周菊华等发现,同是瑞香芽外植体,当培养基中激素为KT+IBA时,KT为1mg/L和2mg/L的玻璃苗率无多大差异,均为8.3%左右.使用相近浓度的BA+NAA时,玻璃苗率却猛增至37.5%.李瑶等在香石竹培养中也发现,当6-BA浓度增加,玻璃苗的比例也增高.说明激素种类和浓度对玻璃苗的发生有重要影响.但激素对玻璃苗的影响程度随外植体种类和琼脂浓度的不同而异.Leshem等观察到,NAA的用量增加也会导致玻璃化,这可能是过量的NAA诱导了培养物内源细胞分裂素浓度过高造成的.张燕玲等在试验中发现,加入细胞分裂素BA和KT.或是改变细胞分裂素的浓度,对丝石竹玻璃苗形成都没有影响.另外,Debergh等认为外源赤霉素,Kevers等和PhanE.认为乙烯对玻璃化的发生没有明显的影响.而张昆瑜等观察到在培养基中加入乙烯前体ACC或乙烯利对克服香石竹试管苗玻璃化有良好作用.因此,外源激素对试管苗玻璃化的影响并不完全一致,有待进一步研究.根据笔者的经验,在培养基中加入5~10mg/L的PP333可以有效的防止少花龙葵试管苗玻璃化的出现,可以起到很好的壮苗的效果.3.1.3.使用材料和热击陈龙清等在日本早小菊的培养中以棉塞封口的在不断继代中无一出现玻璃化,而以聚乙烯塑料薄膜封口的,随继代次数增加出现玻璃化,继代5次时有30%的玻璃苗出现.李云等报道,球美海棠用塑料膜封口比纸封口材料显著地增加病情指数,只要降低培养瓶中的相对湿度,就可以降低玻璃苗率.用棉塞和纸等透气性较好的封口材料封口有效地降低了容器中的相对湿度,从而抑制了玻璃苗的出现.此外,用40℃热水处理瑞香愈伤组织培养物,可以完全消除再生苗的玻璃化,且能够提高愈伤组织的芽分化的效率Coors等报道,热击可降低内源细胞分裂素的水平,这也许是热击可以消除玻璃苗的原因.培养基的pH值大小也能影响试管苗的玻璃化,香石竹在pH6.2的培养基上的玻璃苗率要显著高于pH7.0的培养基中玻璃苗率.聚乙烯醇(PVA)对试管苗玻璃化也有影响,均能降低玻璃苗的产生.3.2聚乙烯培养基的预防方法试管苗玻璃化现象是观赏植物快速繁殖和工厂化生产、茎尖脱毒、种质保存等方面的一大障碍,给生产造成极大损失.因此,在实际工作中,有必要采取措施使试管苗的玻璃化现象降低到最低限度,直至消除玻璃化现象.综合有关的资料和研究成果和笔者的实际工作经验,可以采取以下预防措施.(1)在MS培养基中,减少或除去NH4NO3,或采用低水平的NH4+如,改良的MS和B5等基本培养基.(2)适当降低细胞分裂素6-BA的用量,在继代培养中,采用附加不同种类和浓度的激素如KT,IBA等的培养基.(3)增加琼脂(1%以上)和蔗糖(4%以上)的用量,避免采用葡萄糖作碳源.(4)在培养基中可附加聚乙烯醇(PVA)、活性炭等.(5)用棉塞代替聚乙烯塑料薄膜作为封口材料,利用固体培养基,增加琼脂浓度,从根本上降低培养基中的水势.(6)增强光照强度,如果有条件比如在温室里面可以置于太阳光中培养.(7)在培养基中加入5~10mg/L的PP333(多效唑).5外植体褐变现象研究状况近20年来,植物组培技术由于自身独特的优势,在无性系快速繁殖、脱毒苗的培育、加快育种进程、优良品种选育和种质资源低温保存等方面都取得了明显的经济效益、社会效益和生态效益,其在科研和生产应用上的作用也越来越重要.但是由于微生物污染、褐化、玻璃化和遗传性状变异等问题困扰和制约着植物组培的发展.在接种和培养过程中,污染率常常高达10%以上.防止细菌特别是内源细菌污染是一项重中之重的工作.对此,目前的理想措施就是在培养基中加入抑菌剂、抗生素等.实践中,抗生素一般不稳定,遇酸、碱或加热都易分解而失去活性,对瓶苗的分化和生长有一定的抑制,在组培规模化育苗中应用,由于抑菌剂、抗生素不耐热,须人工在超净工作台逐瓶加入,工作量大,成本增加.从而降低经济效益,所以寻找和开发性能稳定、价格适宜的抑菌剂还有待更深入的研究.抗生素消除细菌的研究比较多,但是目前酵母菌污染的研究相对较少.霉菌污染在植物组培中造成的损失非常大.霉菌污染的一个重要特点是污染迅速,难控制.目前,关于霉菌污染抑制可采用制霉素,但同样存在不稳定,遇酸、碱或加热易分解而失去活性,工作量大,成本增加等问题,且该方面的研究还很少.有人建议用防腐剂抑制污染,但还未见报道.因此,加强组培过程中常见的菌(细菌、霉菌、酵母菌)防治技术研究非常必要.引起组织培养过程中外植体褐变的因素不外乎两方面,一方面是外植体本身的原因