巴西橡胶树胶乳中大小橡胶粒子的分离纯化

巴西橡胶树胶乳中大小橡胶粒子的分离纯化

0橡胶树乳管细胞生物合成活性的变化自然界生产着2500多种橡胶植物。然而，只有巴西的橡胶树才能生产大量高质量的天然胶，这是世界上天然胶的主要来源。橡胶粒子是巴西橡胶树乳管细胞中的一种特殊细胞器,是橡胶树胶乳的主要成分,约占胶乳的30%~45%(v/v),其主要生物学功能是进行橡胶生物合成。与其他植物细胞器相似,橡胶粒子可能起源于内质网,但也有研究表明橡胶粒子是在细胞质中自由形成。最初形成的为小橡胶粒子(smallrubberparticle,SRP),呈电子致密的小球状,直径为40~60nm;随着进一步发育和体积增大,橡胶粒子的中央区成为电子透明状态。成熟的橡胶粒子,又称为大橡胶粒子(largerubberparticle,LRP),是由单层生物膜包被而成的电子透明梨形或圆形球体,最大直径可达2μm,合成的橡胶分子储藏在橡胶粒子中。橡胶树乳管细胞中的橡胶粒子不仅大小差异较大,而且它们还具有不同的橡胶生物合成活性,即小橡胶粒子的橡胶生物合成速率明显大于大橡胶粒子,表明大橡胶粒子中可能存在导致橡胶生物合成终止的生化机制。橡胶生物合成包括起始、延长和终止3个连续而有序的过程。目前,关于橡胶生物合成及其调控的分子机理尚不完全清楚。橡胶粒子膜组分中的酶和蛋白因子在催化和调控橡胶生物合成反应中起着非常重要的作用。橡胶树乳管细胞中的大小橡胶粒子在结构和膜组成上表现出一定程度的差异,这种膜结构和组分上的变化,可能与大橡胶粒子橡胶生物合成速率的下降直至橡胶生物合成的终止具有一定的相关性。最近,Sando等的研究证明,小橡胶粒子主要分布于橡胶树韧皮组织的内层乳管细胞,而外层乳管细胞则主要含有大橡胶粒子,并认为大小橡胶粒子中都存在的高丰度表达蛋白橡胶延长因子(rubberelongationfactor,REF)可能也是橡胶生物合成的终止因子。虽然已通过蛋白质组学的方法对橡胶树橡胶粒子蛋白质的表达谱进行了研究,但是迄今为止,还没有报道过大小橡胶粒子的有效分离方法,更不清楚橡胶树大小橡胶粒子之间的差异表达蛋白,而大小橡胶粒子蛋白质表达模式的变化可能是它们具有不同的橡胶生物合成活性,并导致大橡胶粒子橡胶生物合成终止的重要原因。为此,笔者建立了从橡胶树胶乳中分离出大小橡胶粒子的差速离心的方法,这将为鉴定大小橡胶粒子之间的差异表达蛋白,以期为进一步研究橡胶生物合成的分子机制以及橡胶粒子的起源和发育提供参考。1材料和方法1.1试验研究与试验设备研究田间试验于2010年10月在中国热带农业科学院试验场4队进行,室内试验于2010年11月—2011年9月在中国热带农业科学院橡胶研究所进行。1.2热研7-33-97试验材料为种植在海南省儋州市中国热带农业科学院试验场4队的巴西橡胶树(HeveabrasiliensisMull.Arg.)无性系热研7-33-97,割龄为3年,按1/2树围、3天1刀的常规割制割胶,未用乙烯利刺激。通过正常割胶,将割胶后5~30min内排出的橡胶树新鲜胶乳收集于冰浴中的干净离心管内,带回实验室进行橡胶粒子的分离以及橡胶粒子蛋白的提取与纯化。1.3测试方法1.3.1橡胶树胶乳总橡胶粒子的分离将收集到的橡胶树新鲜胶乳在4℃16000r/min条件下离心60min,收集位于离心管顶层的橡胶粒子部分,用5倍体积的等渗溶液(10mmol/LTris-HCl、250mmol/L蔗糖,pH7.0)充分悬浮并洗涤橡胶粒子3次,4℃16000r/min条件下离心15min,收集纯净的橡胶粒子,即为大小橡胶粒子尚未得到分离的橡胶树胶乳总橡胶粒子。然后,采用12000~18000r/min差速离心的方法,分别从等渗溶液悬浮的总橡胶粒子中分离大橡胶粒子和小橡胶粒子。1.3.2橡胶粒子悬液的固定和干燥参照Singh等的方法并作改进。取悬浮于等渗溶液中的橡胶粒子,加入等体积6%戊二醛溶液(用0.05mol/L二甲基砷酸钠配制,含1%单宁酸),室温下固定橡胶粒子2h,离心去除固定液,并用等渗溶液洗涤橡胶粒子3次,离心收集橡胶粒子,然后将橡胶粒子悬浮在1%锇酸固定液中,室温下固定1h,离心去除固定液,用纯净水洗涤橡胶粒子2次,离心收集橡胶粒子,最后将橡胶粒子充分悬浮在适当体积的纯净水中。取1滴固定好的橡胶粒子悬浮液滴在干净的锡箔纸上,室温下干燥过夜。经E-1010型喷镀仪(Hitachi,Japan)真空喷金后,用S-3000N扫描电子显微镜(Hitachi,Japan)观察固定好的橡胶粒子。1.3.3信大糖酸酯酶抑制剂单次给药法roge-4h2o参照段翠芳等的方法并作改进。将离心分离后的橡胶粒子转移到5倍体积的蛋白提取液中,并使橡胶粒子充分悬浮,蛋白提取液为50mmol/LHepes-Tris缓冲液,pH7.5,其中含8mol/L尿素、2mol/L硫脲、5mmol/LEDTA-Na2·2H2O、10mmol/Lβ-巯基乙醇、60mmol/LDTT、0.5mmol/LPMSF、4%Chaps、1%NP-40和蛋白酶抑制剂(RocheAppliedScience),4℃下搅拌抽提30min后,在冰浴中超声处理3min。将蛋白抽提液在4℃16000r/min离心60min,吸取下层清液,并在4℃24000r/min继续离心90min,吸取下层清液。用ReadyPrep2-DECleanupKit(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)进行蛋白质纯化,收集橡胶粒子蛋白,并溶解在2×SDS样品缓冲液中,-80℃条件下保存。1.3.4电泳条件及蛋白质上样量用常规SDS的方法对橡胶粒子蛋白进行电泳分离,分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为4%,电泳条件为恒流25mA。蛋白质上样量为80μg。电泳结束后,将凝胶于适量体积的考马斯亮蓝R250染色液(50%乙醇,10%乙酸,1‰考马斯亮蓝R-250)室温下染色2h,用脱色液(40%乙醇,10%乙酸)脱色2h,最后在3%乙酸中脱色3h。1.3.5rpp对橡胶颗粒蛋白质的质量分析和评价从SDS胶上切取小橡胶粒子蛋白泳道上与SRPP分子量对应的蛋白带,参照段翠芳等1.3.6转移效果转移橡胶粒子蛋白的Westernblotting分析参照Zeng等的方法。SDS结束后,用电转移的方法将蛋白带转移至硝酸纤维素膜上,丽春红染色以检测蛋白质的转移效果。将印迹有蛋白的硝酸纤维素膜用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液(20mmol/LTris-HCl、150mmol/LNaCl、0.1%Tween20)室温下封闭1h,然后在室温下与橡胶粒子蛋白REF的单克隆抗体(抗体与封闭液的体积比为1:1000)孵育1h,用TBST洗膜4次、每次l0min,将膜与辣根过氧化酶藕联的羊抗小鼠IgG(抗体与封闭液的体积比为1:10000)室温下孵育1h,用TBST洗膜4次、每次l0min,最后将膜放入显色液中进行蛋白带的显色反应。2结果与分析2.1橡胶粒子的分离方法橡胶树胶乳中存在着可引起橡胶粒子凝絮的物质,在离体条件下,胶乳中的橡胶粒子容易发生凝絮,从而导致橡胶粒子的凝固。因此,长期以来,橡胶树胶乳大小橡胶粒子的分离方法都未得到有效地解决。根据橡胶粒子体积大小的不同而存在密度上的差异,本研究建立了使用不同离心力分离大小橡胶粒子的差速离心分离方法,其中在12000~18000r/min离心力范围内,可以使胶乳中的大小橡胶粒子分别得到有效的分离。试验过程中,使用等渗溶液悬浮和洗涤橡胶粒子不仅可以充分去除污染的杂质,而且还可使橡胶粒子保持完好的形态,橡胶粒子不会因为多次洗涤和高速离心而破裂。为了鉴定到更多的与橡胶粒子结合的外周蛋白,洗涤橡胶粒子的等渗溶液选择pH7.0的中性溶液,洗涤次数不宜超过3次。2.2橡胶显微镜表征为了检测差速离心分离法分离纯化大小橡胶粒子的效果,应用扫描电子显微镜(SEM)对纯净的橡胶粒子进行观察和比较。在未经分离的橡胶树胶乳橡胶粒子中,根据发育程度的不同,可明显地区分为小橡胶粒子(SmallRubberParticle,SRP)和大橡胶粒子(LargeRubberParticle,LRP),以及体积大小介于这两者之间的其他橡胶粒子(图1A),这与用透射电子显微镜(TEM)观察橡胶粒子的结果一致。通过差速离心法适当调节离心力的大小,可将橡胶树胶乳中的大橡胶粒子(图1B)和小橡胶粒子(图1C)有效分离出来。在试验过程中始终使用等渗溶液充分洗涤和悬浮橡胶粒子,一方面可使分离的橡胶粒子不易发生破裂而保持原状,另一方面可最大程度地消除其他细胞组分和蛋白质的污染。2.3橡胶树大小橡胶粒子分子质量分析分别从小橡胶粒子、大橡胶粒子和未经分离的胶乳总橡胶粒子中提取橡胶粒子蛋白,并进行SDS电泳分析。SDS电泳(图2A)和Westernblotting检测(图2B)均证明,不管是小橡胶粒子、大橡胶粒子还是未经分离的总橡胶粒子都具有几乎等量表达橡胶延长因子(REF)蛋白。REF是存在于橡胶粒子上的高丰度表达蛋白,因为它在大小橡胶粒子上的表达没有差异,因此,REF可以作为研究橡胶粒子的起源和发育的标记分子。此外,电泳结果证明,橡胶树大小橡胶粒子的蛋白谱带之间表现出一定程度的差异,尤其是分子量约为24.5kDa的小橡胶粒子蛋白SRPP(SmallRubberParticleProtein)只存在于小橡胶粒子和未经分离的总橡胶粒子中,而在大橡胶粒子中几乎不存在SRPP,这与SRPP是小橡胶粒子的特异表达蛋白相符,进一步对此蛋白带进行了质谱分析与鉴定,其中SRPP的1个水解片段的MS/MS质谱图如图3A所示,经质谱分析,该片段所对应的氨基酸序列为IVLDVASSVFNTGVQEGAK,位于SRPP蛋白质(GI:14423933)序列的第106~124位氨基酸残基之间(见图3B)。除了差异表达蛋白SRPP外,SDS电泳结果还表明,大小橡胶粒子在分子量约为22kDa、35kDa、50kDa、80kDa以及120kDa等蛋白的表达上也存在量的差异,这些差异表达蛋白的性质及其生物学功能现在尚未得到鉴定。从SRPP和REF在大小橡胶粒子上的表达特征可以推测,REF可能并不是橡胶粒子中催化橡胶生物合成的关键蛋白因子,而只在小橡胶粒子上表达的SRPP则可能与大小橡胶粒子具有显著不同的橡胶生物合成速率密切相关,然而,目前对SRPP的生物学功能还未完全确定。3结论和讨论3.1橡胶粒子的生物活性笔者建立的差速离心法,分离纯化橡胶树胶乳中的大小橡胶粒子,具有步骤简单和操作便利等特点,克服了用分子筛等其他方法分离纯化大小橡胶粒子时容易发生橡胶粒子的凝絮、凝固等缺点;试验过程中,始终用等渗溶液悬浮和洗涤橡胶粒子,可避免橡胶粒子因渗透压的改变而导致破裂,从而可以得到完整并具有生物活性的大小橡胶粒子,可进一步用于橡胶粒子的离体橡胶生物合成,以及橡胶粒子蛋白的生物学功能鉴定等研究。洗涤橡胶粒子所用等渗溶液的pH以及洗涤次数,对橡胶粒子的生理活性具有较大的影响。除了橡胶粒子的跨膜蛋白外,与橡胶粒子结合的外周蛋白质对维持橡胶粒子的正常生理功能也具有重要作用。因此,宜用pH7.0的中性溶液洗涤和悬浮橡胶粒子,洗涤次数不宜过多,3次洗涤即可去除大部分污染的胶乳C-乳清蛋白,并可用于大小橡胶粒子的差异表达蛋白分析。3.2橡胶树不同部位菌群差异表达蛋白橡胶树乳管细胞中的橡胶粒子经历了从最初形成的小橡胶粒子至最终变成为大橡胶粒子的发育过程。大橡胶粒子不仅体积不再增大,且橡胶生物合成也已终止。迄今为止,关于橡胶生物合成的起始和终止等橡胶生物合成的分子机制尚不完全清楚。橡胶生物合成是在橡胶树乳管细胞中的橡胶粒子上进行,许多橡胶粒子蛋白,如REF、SRPP和橡胶转移酶等是橡胶生物合成的关键酶或蛋白因子,它们的表达与变化不仅影响橡胶生物合成,而且还与橡胶树的胶乳产量密切相关。SRPP是目前已知的小橡胶粒子特异表达蛋白,并被认为在橡胶生物合成中发挥重要作用。笔者的结果表明,除SRPP外,橡胶树大小橡胶粒子之间