马铃薯茎中线粒体的分离与提取

马铃薯茎中线粒体的分离与提取

壳体是一个重要的细胞遗传因子，在代谢和生物能量转化中起着中心作用。线粒体基因组是一种细胞核外的基因组。是一个相对独立的复制单位,具有DNA复制、转录、转译的自主独立性,又受到核遗传系统的部分控制。一个线粒体中可有一个或n个DNA分子,植物的线粒体DNA(mtDNA)常常由多个mtDNA环组成,对mtDNA及其表达的研究有助阐明生命起源、疾病、衰老、肌体死亡等规律。自20世纪60年代发现线粒体DNA以来,对mtDNA的研究就受到广泛的注意,1997年汪志纯等研究了玉米细胞质雄性不育的mtDNA控制;2000年王俐研究了线粒体的数量与高粱的雄性不育的关系;研究表明植物线粒体的基因组对高等植物的杂交育种提高作物的品质是非常重要的。具有完整功能的mtDNA是研究真核细胞基因组结构及其表达的良好模型。这些研究者使用了多种方法从不同作物中分离制备了mtDNA。然而这些方法的使用受到一些条件的制约,存在一定局限性。本试验在前人研究基础上通过设计适宜的过垫梯度、改进差速离心选用适当的有机试剂进行mtDNA提取纯化。为从高等植物中提取mtDNA提供一种可供选择的方法。1材料和方法1.1材料表面马铃薯块茎为材料。1.2%pv、lg-lg-1.3、4.2/lg-lm-1/lmtis-h在基乙醇1.2.2、l.4-l-4-l2.2、l.2、0.1%b液基乙醇A液:0.3mol/L蔗糖、50mmol/LTris-HClpH7.03mmol/LEDTA、0.1%BSA10mmol/L巯基乙醇、1.0%PVP、10mmol/LMgCl2、0.1%vC;B液:0.3mol/L蔗糖、50mmol/LTris-HClpH8.0、20mmol/LEDTA、0.1%BSA;C液:0.3mol/L蔗糖、50mmol/LTris-HClpH8.0、10mmol/LMgCl2、TE:50mmol/LTris-HClpH8.0、20mmol/LEDTA、1.3方法1.3.1dnaasei-edtaa的制备秤取马铃薯块茎材料200g,加入预冷的2.5倍体积的匀浆缓冲液A。于组织捣碎机中匀浆,4层纱布过滤,滤液4000r/min离心10min,收集上清液。上清液13800×g下离心15min收集沉淀,用A液悬浮沉淀加入MgCl2使其浓度到15mmol/L。加入50μg/mLDNAaseI于冰浴上反应30min。反应完后加入EDTA,至浓度20mmol/mL,以终止反应。加入2倍体积左右的A液。13800×g下离心15min,用B液:重悬浮线粒体沉淀。1.3.2u3000定形法在35moL离心管中自下而上按顺序铺55%,48%,38%,三层糖垫。梯度顶端加5mL线粒体重悬浮液,26000×g下离心90min,(结果见图1)。用弯针头小心地将位于离心管内中部的线粒体条带吸出;用2倍体积A液洗涤,加入MgCl2到15mmol/L,搅匀,13800×g下离心15min,少量C液悬浮沉淀,储存。取一小部分线粒体供观察照相。1.3.3显微镜检查从线粒体储液中取少量线粒体显微观察并照相(图2)。1.3.4脱蛋白的制备参考T.Manitis的方法,取储液加入SDS使终浓度为2%,加入蛋白酶K使终浓度100μg/mL,于37℃水浴保温90min。加入等体积饱和酚∶氯仿(1∶1)于三角瓶中旋转15min。4000r/min离心5min,吸取上层水相。加入等体积氯仿∶异戎醇(24∶1)振荡15min,4000r/min离心5min,吸取上层水相。加入等体积饱和乙醚混匀,反应5min,8000×g离心5min,吸去上层乙醚。将下层在65℃水浴中蒸发除去乙醚。DAN沉淀加入二倍体积冷乙醇,加入1/10体积3mol/LNaAC-20℃下过夜。8000×g离心10min,将沉淀溶于少量TE缓冲液。加入RNase,使浓度为50μg/mL,37℃水浴保温60min。重复苯酚、氯仿/异戊醇脱蛋白的步骤,收集上清液,加入二倍体积冷乙醇沉淀DNA,置-20℃。过夜,12000r/min离心30min收集沉淀并溶于少量TE,-20℃保存。1.3.5提取mtcda的方法按常规方法用紫外分光光度计测定260nm和280nm处的消光值,计算出提取mtDNA的得率与浓度。电泳检测用1%琼脂糖凝胶电泳。吸取5μLDNA样品、2μL缓冲液(0.25%溴酚蓝,40%甘油),80V下电泳45min。紫外灯下观察电泳结果并照相(图3)。2结果与分析2.1“下层区带p”的tdf细胞车架从离心管中,可看到3条明显区带,上层区带L为脂质层;中层区带M为线粒体层;下层区带P为质体层;其他密度高的淀粉粒、细胞杂质沉淀到离心管底部(图1)。其中线粒体密度为1.18g/cm3,线粒体与其他细胞器、杂质得到很好分离。通过过垫梯度线粒体得到很好的分离、纯化。2.2油镜观察及分级马铃薯线粒体悬液稀释20倍后、光学显微镜10×100(油镜),4×倍奥林巴斯数码相机照相,观察到的形态为圆形、椭圆形及杆状线粒体无杂质纯度较理想(图2)。2.3材料选取及材料参数mtDNA测定A260值估算DAN提取量约为340μg/200g材料。mtDNA纯度按A260/A280比值为1.76,比值在1.6～1.8之间说明取得较好效果。2.4电泳试验mtDNA琼脂糖凝胶电泳观察到的带型清晰无拖尾、弥散(图3)。可见马铃薯mtDNA的大小约为2.1万bp。3过蔗糖垫法纯化土地高等植物线粒体密度一般1.18g/cm3,S值为1.1×104S左右,大小0.5～3μm左右。叶绿体,浮力密度1.21g/cm,S值为3×105S左右,大小2～10μm左右。细胞核密度为1.6g/cm3,S值为2×106S,质体密度1.22g/cm3。对于叶绿体和细胞核其S值的差别相差一个数量级以上,利用其质量及S值与线粒体的差异,应用差速离心分离提取线粒体。利用它们密度的差别,通过过垫梯度离心分离纯化,就可除去质膜、高尔基体、质网膜等不需要的部分。线粒体的纯化一般多使用线性或阶梯型密度梯度,本试验采用了过蔗糖垫法,即采用3种密度的蔗糖溶液铺成的三阶垫,该方法有效地分离了脂质体和质体。得到了纯化的线粒体,为mtDNA提取提供了适宜条件。过蔗糖垫与密度梯度法相比有制作简单方便,不需专用设备,可在使用前临时铺制,虽然要求铺制的各垫间界面要清晰,不得让各层间溶液发生混淆,有一定技术操作要求,但它的样品承载量大,结果表明对纯化线粒体是比较适宜的。使用过垫的方法提取线粒体,先前也很少见有报道。线粒体悬液中用DNaseI降解残余nDNA、ctDNA后用SDS裂解线粒体,蛋白酶K消化蛋白质;有机试剂提取用等体积水饱和酚