寡雄腐霉发酵条件优化及其对烟草黑胫病的生物活性

寡雄腐霉发酵条件优化及其对烟草黑胫病的生物活性

0寡雄腐霉pythingonifen-[研究意义]黑胫骨病是中国烟草中常见的真菌疾病，发病率高、分布广泛、危害严重。化学农药的防治效果好,但残效期长、残留量高,大量施用不仅影响农产品安全性,还导致土壤、水体、大气环境质量不断恶化。高效、安全地防治该病害是迫切需要解决的问题。【前人研究进展】目前防治作物病害的主要手段仍然是化学药剂,能代替化学杀菌剂的生物农药较少。寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)定殖于多种重要经济作物,是一种重要的重寄生菌,能有效抑制20多种病原真菌的生长、繁殖,预防和治疗相应病害。研究发现,寡雄腐霉卵孢子接种于黄瓜根系周围,不仅有效降低了根腐病,而且提高了植株体内的生长素含量,促进了生长和磷的吸收。寡雄腐霉产生的小分子物质既能抑制病原菌的繁殖生长,激发抗病防御反应和诱导植物抗病能力,又能促进植物的生理代谢和养分吸收,刺激生长发育。欧洲发达国家已制备出对人畜和环境无毒且高度安全的寡雄腐霉卵孢子制剂,广泛应用于绿色水果和蔬菜生产。【本研究切入点】由于大田应用卵孢子制剂时,难以提供适宜的生存环境,故效果不稳定。通过生物工程方法,利用生防菌的次生代谢产物研制的生物制剂不仅可以提高防治效果,还可克服微生物菌剂效果不稳定的缺点,是研制生物农药的主要方向之一。目前,中国尚无工厂化制备寡雄腐霉发酵液的菌株。【拟解决的关键问题】利用法国引进的寡雄腐霉发酵菌株,研究培养基、温度、初始pH值、培养时间和光照等对寡雄腐霉菌丝生长和发酵液抑菌效应的影响,为进一步分离、纯化、保活有效成分,开展有关后续研究,制备安全、高效的多功能生防制剂奠定基础。1材料和方法试验于2009年3月至2011年9月在西南大学微生物实验室及实验农场完成。1.1真菌病害的防治寡雄腐霉发酵菌株从法国科学家制备的卵孢子获得,对于多种真菌病害均有良好的预防和治疗效果。烟草黑胫病菌、黑胫病中感和高感型红花大金元烟草种子由云南省烟草农业科学研究所惠赠。1.2试验设计1.2.1培养条件对接种法寡雄腐霉发酵的影响将寡雄腐霉接种于PDA培养基,25℃培养7d备用。250mL三角瓶装液量50mL,每瓶6片固体菌种(菌丝直径=6mm),分别研究培养基、温度、初始pH值、发酵时间和光照对寡雄腐霉菌株生长及其发酵液(Pythiumoligandrumfermentationbroth,简称POF)对烟草黑胫病菌抑制率的影响。(1)培养基:工业发酵生产微生物次生代谢产物常选用原料来源广、成本低廉的天然培养基。为此,试验分别以花生饼粉、黄豆饼粉、菜籽饼粉、棉籽饼粉为主要原料,各取60g于去离子水中浸泡5h,70℃水浴2h,过滤,滤液加15g葡萄糖,定容至1L,分装灭菌。发酵条件为pH5.0、25℃、150r/min培养7d,筛选适宜培养基。(2)温度:真菌通常适宜在25—28℃生长。试验设置20、25、30、35、40℃5个梯度,发酵条件为花生饼粉培养基,pH5.0,150r/min培养7d,筛选适宜发酵温度。(3)pH值:真菌通常适宜在pH4.5—6.0范围生长。试验设置pH3.0、5.0、6.0、7.0、9.05个梯度,发酵条件为花生饼粉培养基,30℃,150r/min培养7d,筛选适宜pH值。(4)发酵时间:试验设置3、5、7、9、11d5个时间,发酵条件为花生饼粉培养基,pH5.0,30℃,150r/min,筛选适宜发酵时间。(5)光照:考虑到光照是许多真菌生长发育的重要环境因子,采用SPH-211B-GZ光照培养振荡摇床,试验设置0、12、24h·d-13种照光时间,光照强度15000lx,发酵条件为花生饼粉培养基,pH5.0,30℃,150r/min培养5d,研究光照对寡雄腐霉发酵的影响。供试菌株发酵完成后,8000r/min离心10min得发酵液,发酵液抑菌效应测定见1.2.3。所得菌丝80℃烘干至恒重,差量法称重,每瓶菌丝干重设置为菌丝生物量(mg)。每个处理5次重复。1.2.2利用正交试验确定各因素最佳值根据上述单因素试验结果,将最佳光照时间设定为固定培养条件,以培养基、pH值、温度、时间为因素,取各因素最佳值并选用L27(313)正交表进行四因素三水平设计(表1),菌丝生物量作观测指标,进行发酵参数的优化试验。培养容器、接种方式和摇床速率等同1.2.1,试验设置5次重复。1.2.3不同培养条件对烟草黑测定的影响寡雄腐霉发酵液对烟草黑胫病菌孢子萌发的影响:取最佳发酵参数制备的发酵液和烟草黑胫病菌孢子悬浮液(约1×104CFU·mL-1),按1﹕1体积混合,以病菌孢子悬浮液加等量的灭菌发酵液为对照,在25℃条件下培养24和48h,用显微镜观察孢子萌发情况。各处理镜检60个游动孢子,芽管长度超过孢子直径一半视为孢子萌发,并计算孢子萌发率(萌发孢子数/检查孢子数×100%)和抑制率{(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100%}。试验设置5次重复。(2)寡雄腐霉发酵液对烟草黑胫病菌菌丝生长的影响:将烟草黑胫病菌接种于燕麦培养基,28℃培养5d,再用直径为6mm的打孔器沿菌落边缘打取菌丝,分别接种于含2mL发酵液和等量灭菌发酵液的燕麦培养基上,28℃培养5d,用十字交叉法测量菌落直径,计算抑制率{(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%}。试验设置5次重复。(3)寡雄腐霉发酵液对离体烟叶黑胫病的防治作用:温室盆栽种植供试烤烟品种至现蕾期,取健康、均匀一致的叶片用无菌水洗净。在无菌条件下,将叶片剪成长60mm×40mm的长方形,在叶片背面涂抹发酵液2mL,晾干后接种烟草黑胫病菌的孢子悬浮液20μL(放大100倍,每视野1个孢子囊),以接种病原菌涂抹灭菌发酵液的高感品种叶片为对照。取灭菌后的培养皿,先在培养皿底部垫一张湿润滤纸,再放置烤烟叶片,加盖,28℃培养4d,观察发病情况,统计形成的病斑面积与叶片面积之比。试验设置10次重复。(4)寡雄腐霉发酵液对烟草黑胫病的温室防治效果:温室盆栽种植供试烤烟品种至7叶龄。设置(1)清水灌根(CK);(2)10mL/株黑胫病菌孢子悬浮液灌根(约1×104CFU·mL-1,病菌);(3)用10mL/株黑胫病菌孢子悬浮液灌根,24h后10mL/株发酵液灌根(病菌+发酵液);(4)10mL/株发酵液灌根,24h后用10mL/株黑胫病菌孢子悬浮液灌根(发酵液+病菌)。待接种病菌的处理发病后开始调查发病率和病情指数,每个处理10株烟苗,重复3次,共30株烟苗。病情调查和分级标准采用国标GB/T23222-2008。1.3统计分析方法用Excel2003对试验数据进行基本计算,DPSv6.50软件进行统计分析,采用LSD法进行多重比较,显著水平P<0.05。2结果2.1培养温度和时间对黑测定菌生长和发酵液抑菌率的影响由图1可见,在不同液体培养基中,寡雄腐霉的菌丝生物量以棉籽饼粉培养基最低(53.7mg),花生饼粉培养基最高(77.5mg)。发酵液对烟草黑胫病菌丝生长的抑制率为42.1%—69.5%,以黄豆饼粉培养基最高。在≤30℃范围内,随着温度升高,寡雄腐霉的菌丝生物量和发酵液对黑胫病菌丝生长的抑制率升高,30℃时达峰值,分别比20℃时提高34.1%(菌丝生物量)和8.6%(抑菌率);培养温度≥30℃,菌丝生物量和发酵液的抑菌效应降低。寡雄腐霉的菌丝生物量在pH3.0时最低,pH5.0时最高,达到116.4mg;pH值超过5.0,菌丝生物量则随pH值升高而降低。发酵液抑菌率的变化与菌丝生物量的变化趋势类似。随着培养时间的延长,寡雄腐霉菌丝生物量持续增加。但是,发酵液对黑胫病菌丝生长的抑制效应在5d时最强,抑制率为84.3%,之后,随着培养时间的延长,发酵液的抑菌作用下降。光照24h·d-1,寡雄腐霉菌丝生物量最高,发酵液的抑菌作用最强,菌丝生物量和抑菌率分别比暗培养提高45.7%和82.9%,比光照12h·d-1提高30.2%和33.5%。统计分析表明,在不同培养基、温度、pH和光照等条件下,寡雄腐霉的生物量越大,发酵液对烟草黑胫病菌的抑制作用愈强,二者的相关系数r=0.77**(n=16)。2.2初始ph值对寡雄腐霉菌丝生长的影响表2为不同培养因素的交互作用与优化组合。极差分析表明,4种试验因素对寡雄腐霉生长影响的大小顺序为初始pH值>培养基>发酵时间>发酵温度,其中,初始pH值和培养基对寡雄腐霉菌丝生长的主效应达显著水平,pH值与温度、pH值与培养基、温度与时间等之间也存在显著的交互效应。综合方差分析寻优获得A3B2C2D2(初始pH6.0、发酵温度30℃、发酵时间6d、黄豆饼粉培养基)的菌丝生物量最高,达到162.26mg(图2)。尽管A3B2C2D2的菌丝生物量与A3B1C1D2、A3B2C3D2无显著差异,但显著高于其余试验组合,菌丝生物量高低之间最大相差10倍。2.3浓度发酵液对烟草黑私家车子萌发的影响由表3可知,寡雄腐霉发酵液显著抑制烟草黑胫病菌的孢子萌发。用发酵液处理24h,病菌孢子萌发的抑制率分别为52.9%(100%发酵液)和42.4%(50%发酵液),高浓度发酵液的抑制作用大于低浓度发酵液;加发酵液48h,病菌孢子萌发的抑制率分别为47.7%和45.8%,高低浓度之间无显著差异。图3所示,寡雄腐霉发酵液显著抑制烟草黑胫病菌丝生长,抑制率高达68.3%—78.9%,高浓度发酵液的抑制作用大于低浓度发酵液。此外,在加发酵液的处理中,黑胫病菌菌丝稀疏,生长不均匀。2.4降低烟毒病情系如图4所示,用寡雄腐霉发酵液处理离体烟草叶片,显著降低烟叶黑胫病的病情指数,分别从对照的91.3降低至22.6—28.0,防治效果达到75.3%(中感品种)和69.3%(高感品种)。2.5病情指数:2.9%,病情指数是第20e由表4所示,不接种病菌的烟苗不发病。接种病菌的烟苗黑胫病发病率高达86.7%,病情指数42.9。在接种病菌后根灌发酵液和根灌发酵液后再接种病菌的处理中,发病率和病情指数显著降低,分别为23.3%—26.7%(发病率)和16.6—19.3(病情指数),防治效果达到55.0%—61.3%。3寡雄腐霉发酵液对烟草黑测定的影响寡雄腐霉形成卵孢子,人工产孢困难,限制了其普遍应用。此外,卵孢子的萌发和菌丝生长与环境条件密切相关,其促生防病效果受环境因素的影响,稳定性较差。利用寡雄腐霉发酵菌株优化发酵条件,攻克有效产物的高效提取、储存、保活和施用技术等可以更好地用于植物真菌病害的生物防治。培养基、初始pH值、培养温度、发酵时间和光照不同程度地影响寡雄腐霉的菌丝生长和发酵液对烟草黑胫病的生防效应,类似哈茨木霉等生防菌。光照是许多真菌生长的重要环境因子,连续光照有利于寡雄腐霉菌丝生长和分泌抗菌物质。一般而言,在适宜的培养条件下,微生物生长快,生物量大,代谢旺盛,次生代谢产物的分泌也越多;但抑菌活力总体上随培养时间的延长而升高,到后期却降低,可能是因为菌丝老化等原因,本研究单因素试验表明,在不同培养基、初始pH值、培养温度、光照等条件下,寡雄腐霉的生长量越大,发酵液对烟草黑胫病菌的抑制作用一般也愈强,相对于发酵液的抑菌效应,菌丝生长方便观察,生物量容易测定。因此,在发酵过程中,可用寡雄腐霉的菌丝生物量指示抗菌物质的活性和分泌量,反映发酵液对烟草黑胫病菌的抑制效应。微生物发酵是一个复杂、动态、受多因素影响的生物化学过程。在发酵过程中,菌体生长、产物形成、底物消耗、氧气传递等都处于不断变化之中,基质消耗、菌体生长、次级代谢产物分泌之间互相联系。培养基、初始pH值、培养温度、发酵时间和光照等对微生物发酵的影响极大,它们之间互相作用,互相影响,高产发酵需要各因素之间的最佳配合。目前,国内生防微生物木霉、青霉等发酵条件的优化多采用单因素或正交试验,同时考虑多因素及其交互作用的报道较少。正交试验表明,在照光条件下,以黄豆饼粉为培养基主要原料,初始pH6.0、发酵温度30℃、发酵时间6d,寡雄腐霉菌丝生物量最大,形成最佳组合。黄豆饼粉来源广泛、价格低廉,性能稳定,便于采购,适合大规模储藏,有益于工业化制备寡雄腐霉发酵液,且微生物发酵液具备安全、无污染、易降解等优点,生产应用中对环境友好。此外,在发酵过程中,寡雄腐霉可能分泌水解酶,利用黄豆饼粉中的大分子有机物,如蛋白质和淀粉等。寡雄腐霉发酵液抑制烟草黑胫病菌孢子萌发和菌丝生长,菌丝稀疏且不均匀。说明发酵液中含有抗生物质对黑胫病菌丝和孢子有抑制作用,与前人的研究结果一致。据报道,寡雄腐霉的抗生作用是由于产生大量的胞外溶解酶如β-1,3葡聚糖酶、脂酶、蛋白酶和纤维素酶所致。王爱英等的研究表明,固体培养的寡雄腐霉能分泌分子量小于8kD抗菌物质,对森禾腐霉(P.sylvaticum)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、黄色