基于dna条形码技术的牡丹组植物物种识别与进化分析

基于dna条形码技术的牡丹组植物物种识别与进化分析

dns-mans首席法官是利用dna序列信息来识别物种或物种的异常类型的生物学技术。weich和phone早期假设用磷酸序列信息来识别物种，但由于当时需要进行dna序列测量，这一假设很难实现。20世纪80年代以来，随着pcr技术的发展，“dna标签”技术得到了广泛应用于各种分子标记技术的应用，并成为dna计数技术的前身。然而，由于分子标记技术（如afil、issrrand等）通常是“匿名标记”，因此d段差异的同源性受到质疑。随着dna序列测量技术的发展，对分子系统发育的研究提供了大量仔细鉴定的序列信息和dna序列信息，因此历史学家、遗传科学家和进化心理学家假设用dna序列来确定物种。2003年，美国冷泉港举行了两次dna和病理学研究课程。2004年，成立了“生命法案联盟”。这一系列活动推动了dna和儒学在英国和台湾的快速发展。heber和其他人[2]。首先，以克林威治州（co）在5下排列的细胞色素上（co）进行了分析和鉴定。之后，欧美国家投入大量资金进行本地物种dna序列研究。动物之后，植物也进行了dna标签技术的开发。例如，kps等人建议将中国政府和台湾的sh和co-l-植被代码（co）进行系统和开发。DNA条形码技术的原初设想是用一个经济高效的“通用”标记鉴别尽可能多的物种,如用COI鉴别动物.然而,植物的情况比动物要复杂得多.(ⅰ)由于同一基因在不同类群的进化速率不同,至今还没有找到类似COⅠ的普遍适用的“通用标记”;(ⅱ)叶绿体基因虽然序列测定简便,但在有些情况下(如木材中)得不到叶绿体DNA,限制了其应用范围;(ⅲ)物种的形成是非常复杂的进化过程,杂交和网状进化事件可能使不同物种带有相同的叶绿体或线粒体基因组,同一物种也可能带有不同的叶绿体或线粒体基因组,导致单基因组标记有时不能准确鉴别这样的物种;(ⅳ)如果基因组之间存在遗传物质交流(如基因侧向转移),单一基因标记可能得出错误结果因此,DNA条形码技术的广泛应用除了技术上的困难之外,还必须澄清与类群有关的物种问题.牡丹是芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)牡丹组(Paeoniasect.MoutanDC.)植物的统称,是家喻户晓的观赏花卉和药用植物,原产于我国.虽然牡丹组植物的观赏价值和药用价值的利用已经有近两千年的历史,但对牡丹组植物的物种问题仍缺乏深入的研究.栽培的牡丹(P.suffruticosaAndrews)是最早被分类描述的物种,以后陆续有少量新类群被发现.20世纪90年代以来,牡丹组植物野生种质资源的搜索取得重要进展,发现了不少的变异类型,有些变异类型被描述为新物种或种下新分类群[9~15],一些原来没有被认识清楚的类群也得到了确认或者澄清[16~21].随着被描述类群数量的增加,牡丹组物种之间关系的复杂性就显现出来了,一些分类学家和园艺学家在Stern和潘开玉研究的基础上开始对牡丹组植物进行分类修订[22~35].由于对物种概念的理解和对牡丹组植物形态变异的了解程度不同,不同的分类处理之间有较大的出入.要解决这些由于对形态变异的认识不同而产生的分类学问题,必须借助于独立于形态特征之外的分子标记.目前牡丹组植物的分子系统学研究主要关注种间进化关系[36~38],这些进化关系的正确性受到样品的代表性和样品鉴定正确性的制约,在此基础上揭示的类群间的进化关系又会反过来影响人们对类群的正确认识.牡丹组植物是我国特有的生物资源,园艺工作者利用这些资源培育的大量牡丹品种,为国内和国际园林花卉事业做出了巨大贡献.为了深入了解我国牡丹组植物遗传资源的现状,有效鉴定牡丹组植物遗传资源,开展了对牡丹组植物遗传资源的DNA条形码技术研究.本文是这项工作的初步总结目的是:(ⅰ)利用DNA序列信息建立牡丹组植物不同类群或不同变异类型之间的系统发育关系;根据系统发育关系反思牡丹组物种的限定,进而探讨DNA条形码技术中的“物种”问题;(ⅱ)以牡丹组植物为例,通过分析不同基因片段的分辨力和根据不同基因组数据所得到的不同结果,探讨DNA条形码技术中的单标记与多标记、统一标记与专用标记等一般性问题.1材料和方法1.1川牡丹花居群系统牡丹组植物分布于我国的西藏、云南、四川、甘肃、陕西、湖北、安徽、河南、山西等省区.对这些省区进行了详细的调查,采集了32个居群的标本和实验材料共37份(表1),包含了目前被多数分类学家所接受的所有物种.除个别物种仅存在单株外,每个物种均有多个居群材料.四川牡丹(P.decompositaHand.-Mazz.)的理县居群、茂县居群和马尔康居群形态上的变异和叶绿体DNA序列上的有显著差别,紫斑牡丹(P.rockii(S.G.HawetL.A.Lauener)T.HongetJ.J.LiexD.Y.Hong)的东部(子午岭、秦巴山区等)居群与西部(陇南及其邻近地区)居群在叶绿体DNA序列上有显著差别,因此四川牡丹的居群被划分为3个居群系统,紫斑牡丹的居群被划分为2个居群系统来分析(表1).栽培牡丹来源复杂,选取了最接近P.suffruticosa模式的3个传统栽培品种作为代表.1.2dna测序和序列分析总DNA采用CTAB法提取并用试剂盒(WizardDNAClean-UpSystem,Cat.#A7280,Promega)纯化.叶绿体基因用PCR产物直接测序法测定序列,核基因的PCR产物用试剂盒克隆测序,每个样品至少测定8个克隆.基因片段的扩增所用引物参考Sang等人.所获得的序列用Sequencher(v4.6)校对拼接,用ClustalX比对后,用Se-Al作手工调整.数据用PAUP4.0b10分析物种间的系统发育关系,用DnaSP统计DNA序列分化,用Arlequin分析类群间遗传分化程度.2结果2.1叶绿体分布及序列选择了进化速率比较快、适合区分物种的叶绿体基因组4个基因的部分序列.比对后位点总数5040个(含具信息的插入/缺失位点),变异位点总数96个,其中信息位点数69个.比较这些序列在同一物种的不同群体间和不同物种间的变异特点,寻找物种专一性的序列变异位点.(1)叶绿体基因的种内变异.大花黄牡丹和滇牡丹:大花黄牡丹仅分布于西藏林芝地区,获得林芝和米林两个居群的材料.这两份材料除了trnL-F序列有一个变异位点外,其余完全一样,也没有缺失/插入的差异.滇牡丹的4个居群,代表了黄牡丹、紫牡丹等多种变异类型.rps16-trnQ序列有6个突变和由poly-结构造成的缺失/插入,但都为非信息位点;ndhF序列也只有7个非信息位点.四川牡丹:叶绿体基因组4个基因显示四川牡丹具有三类单倍型.第一类为马尔康地区的居群所特有,第二类为理县居群所特有,第三类为茂县一带的居群所特有.这三类单倍型内部序列差异都很小,但三类之间完全分化位点数目在10个以上(表2),特别是第一类与其他两类的差别除了丰富的碱基突变外,rps16-trnQ序列还有两个相关缺失,长度分别为252和5bp.值得注意的是,这两个缺失并非四川牡丹的马尔康地区居群所特有,在紫斑牡丹、矮牡丹和卵叶牡丹中也有,说明它们在起源上存在密切的关系.紫斑牡丹:紫斑牡丹的分布较广,陕北子午岭、秦岭中西部、大巴山地区都有分布.紫斑牡丹的叶绿体单倍型非常丰富,也可归结为两大类.第一类为子午岭、秦岭和大巴山等地区(东部)居群,居群之间有5个多态位点,而且rps16-trnQ序列存在252和5bp的两个相关缺失.第二类为甘肃陇南及其邻近地区的居群(西部居群),居群之间只有两个多态位点.矮牡丹:矮牡丹仅分布于山西、陕西、河南3省交界的狭小地域.不同群体的叶绿体基因几乎没有差异,rps16-trnQ序列有两个变异位点;ndhF序列有两个变异位点,其中1个信息位点;trnL-F序列和trnS-G序列没有变异位点.卵叶牡丹:卵叶牡丹是非常濒危的物种,曾分布于河南和湖北两省,目前仅见于湖北保康县和神农架地区.保康县居群与神农架居群在ndhF基因有1个A/G代换差异,其他基因均没有差异.杨山牡丹:杨山牡丹只有极其稀少的个体散布在河南、安徽、湖北等省,没有真正的野生群体.来自这些孤立野生个体的叶绿体基因序列完全一样.牡丹和中原牡丹:牡丹最初是根据栽培品种发表的物种,但到底是基于哪个品种描述尚待考证.选择了3个与牡丹模式图比较相似的品种为代表.中原牡丹是最近发表的物种,目前只有一个模式植株.这4份材料在叶绿体基因组上完全相同.(2)近缘种间叶绿体基因的分化.牡丹组植物无论在形态上还是在基因序列上都表现为亲缘关系更为密切的姊妹种关系,如滇牡丹与大花黄牡丹、紫斑牡丹与四川牡丹、矮牡丹与卵叶牡丹、牡丹+中原牡丹与杨山牡丹.这些物种之间或物种内部居群系统之间的分化程度差异很大(表2).滇牡丹与大花黄牡丹:滇牡丹包括花紫红色、黄色和花白色的类型以及各种过渡花色的中间类型.在27个突变位点中,滇牡丹与大花黄牡丹有5个(18.52%)完全固定的分化.从叶绿体基因看,大花黄牡丹与滇牡丹的分化甚至小于滇牡丹内部一些居群间的分化.滇牡丹不同居群表现出花瓣颜色的多态性,最典型的为花瓣紫红色和花瓣黄色,曾分别被描述为紫牡丹和黄牡丹两个种.这两类花色的居群有20个多态位点,其中3个位点为两类花色的固定差异,小于同为黄色花的西藏居群与云南居群间的差异(17个变异位点中有7个固定差异).紫斑牡丹与四川牡丹:分布于子午岭、秦巴山地和陇南地区的牡丹组野生植物花瓣白色,基部带紫红色斑块,被认为属于紫斑牡丹;分布于四川西部理县、茂县、马尔康一带的居群花瓣粉红色,基部没有紫斑,虽然居群间有一定的差别,被认为属于四川牡丹.如此定义的这两个物种只有1个固定差异,而内部却有40个多态位点.其中,四川牡丹有10个多态位点,紫斑牡丹有20个多态位点,还有10个为两者共有的多态位点.矮牡丹与卵叶牡丹:矮牡丹与卵叶牡丹在小叶数目和心皮特征上一致,rps16-trnQ都有两个相关缺失,但小叶形状和花的颜色明显不同.虽然两者的叶绿体基因只有4个完全分化的位点,但矮牡丹与四川牡丹的马尔康居群仅有一个完全分化位点,卵叶牡丹与紫斑牡丹东部居群也只有一个完全分化位点(表2).叶绿体基因的系统发育分析显示矮牡丹与卵叶牡丹并非姊妹群关系,而这个结果没有得到核基因的支持(图1(A)).牡丹+中原牡丹与杨山牡丹:牡丹与中原牡丹叶绿体基因序列完全一样,但两者与杨山牡丹有11个变异位点,其中8个为完全分化位点.(3)亚组间和革质花盘亚组内两条主进化谱系间的差异.传统上牡丹组被划分为肉质花盘亚组和革质花盘亚组.两个亚组之间叶绿体基因序列分化显著,有85个变异位点(不含poly结构造成的差异),其中含系统发育信息的位点63个,固定差异位点19个(约占变异位点总数的30.15%).在革质花盘亚组中,有两条主进化谱系(图1).一条包括牡丹、中原牡丹、杨山牡丹、四川牡丹的理县和茂县居群,以及紫斑牡丹的西部居群;另一条包括矮牡丹、卵叶牡丹、四川牡丹的马尔康居群,以及紫斑牡丹的东部居群.这两条主进化谱系间最突出特点是除了5个完全分化的固定突变外,在rps16-trnQ序列存在252和5bp的两个相关缺失.2.2gp基因中相关种间的分化.依第5位.云图2.用Tank和Sang最先使用的三磷酸甘油酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphateacyltransferase,GPAT)基因的一个内含子为标记,测定了这个内含子的绝大部分序列.序列长2093~2197bp,比对后位点总数2254个(含具信息的插入/缺失),变异位点总数279个,其中信息位点数148个.(1)GPAT基因的种内变异.牡丹的3个栽培品种间有13个变异位点,这些位点的变异并没有明显的规律,品种之间表现平行关系.杨山牡丹3个居群之间有15个突变位点,河南卢氏县居群与湖北神农架居群具有更近的亲缘关系.四川牡丹有45个变异位点,居群间差异不大,最大值为6个位点,发生在马尔康居群与理县居群之间.紫斑牡丹有42个变异位点,与叶绿体基因不同,居群之间没有明显的有规律的分化.卵叶牡丹只有6个变异位点,矮牡丹有21个变异位点,居群之间均没有明显的分化.大花黄牡丹有9个变异位点.滇牡丹有42个变异位点,其中滇牡丹西藏居群与其他居群有19个(45%)变异位点.(2)GPAT基因近缘种间的分化.滇牡丹与大花黄牡丹:总共64个变异位点,有23个完全分化,其中有3个插入/缺失发生在这两个物种之间;紫斑牡丹与四川牡丹:紫斑牡丹与四川牡丹虽然有81个变异位点,但没有位点完全分化.紫斑牡丹有36个多态位点在四川牡丹中呈现单态,四川牡丹中有41个多态位点在紫斑牡丹中为单态,另有4个位点在两个类群中均为多态;矮牡丹与卵叶牡丹:矮牡丹与卵叶牡丹的密切关系最明显地表现在7和52bp两段插入上,这两段相关插入在牡丹组的所有物种中是唯一的.总共30个变异位点有3个完全分化;牡丹与杨山牡丹:牡丹与杨山牡丹47个变异位点中有12个完全分化的位点,其中包括杨山牡丹特有的一段7bp的缺失;牡丹、中原牡丹与杨山牡丹:中原牡丹被认为是牡丹的野生类型,两者叶绿体基因序列完全一样,GPAT序列与牡丹的3个代表品种仅7个碱基的差异.杨山牡丹与牡丹和中原牡丹有12个完全分化的位点,其中包括杨山牡丹特有的一段7bp的缺失.(3)GPAT基因的亚组间和革质花盘亚组内两条主进化谱系间的分化.肉质花盘亚组和革质花盘亚组间有266个变异位点,32个为完全分化位点,其中1172有7个插入/缺失发生在这两个亚组之间.在革质花盘亚组内,GPAT基因显示两条进化线,一条贯穿中原牡丹-牡丹-杨山牡丹-卵叶牡丹-矮牡丹,另一条贯穿紫斑牡丹和四川牡丹.这两条进化线有179个变异位点,17个位点完全分化,其中有两个位点为插入/缺失.2.3单位位点核苷酸多样性叶绿体基因组4个基因所揭示的革质花盘亚组的单倍型多样性和核苷酸多样性差异并不显著,但单位位点的核苷酸多样性差异明显(图2),其中rps16-trnQ的单位位点核苷酸多样性是其他基因的两倍以上.DNA序列变异的分布式样可以反映该基因片段的鉴别效率.将遗传变异分解为3个层次,即亚组之间、亚组内物种或居群系统之间和物种或居群系统之内.从方差组分看,亚组之间份额最大,物种或居群系统之内份额最小(表3).从贡献率看,物种或居群系统之间的遗传差异相对于物种或居群系统内要大很多,说明这些基因能有效区分物种或居群系统.3牡丹花组植物物种的鉴别牡丹组植物是最负盛名的观赏植物之一,栽培历史悠久,人们对牡丹组植物形态的细微变化也极为关注.由于过分强调了多基因控制的数量性状变异,一些变异类型被描述为物种.同时,牡丹组植物也可能由于人类活动的影响或存在尚未被揭示的进化机制,造成野生类型的进化式样十分复杂,从而导致分类学者认识上的偏差.因此,尽管已有不少的分类学者对牡丹组植物进行了较为广泛的分析研究,但对牡丹组植物物种的认识仍不深入.随着分子生物学技术,特别是DNA测序技术的普及与成本的降低,用DNA序列信息鉴别物种成为可能,并在一些类群中得到运用,DNA条形码技术应运而生[47~53].DNA条形码技术不仅可用于鉴别物种,而且可以利用DNA条形码分析所产生的数据进行系统发育分析,反过来判别人们对物种的认识是否正确.3.1含论和进化研究的前提从芍药属牡丹组DNA序列分化程度(表2)可知,肉质花盘亚组和革质花盘亚组无论是形态上还是遗传上都是两个分化明显的类群.肉质花盘亚组中的滇牡丹和大花黄牡丹核基因分化显著,是两个独立的进化线,分属于不同的物种.滇牡丹不同群体的DNA序列没有显著差异,红花类型和黄花类型过渡地带花瓣颜色的多样性说明这种少数基因控制的性状和多基因控制的复叶裂片的宽窄均不足以作为划分物种的依据.因此,肉质花盘亚组包含滇牡丹和大花黄牡丹是目前比较合理的分类方式.在革质花盘亚组中叶绿体基因组和核基因组分别有两条主要的进化线,每条均有分化清楚的几条谱系,如牡丹+中原牡丹、杨山牡丹、矮牡丹和卵叶牡丹.这两条主进化线在叶绿体基因组和核基因组之间的交叉,导致紫斑牡丹和四川牡丹的形态分化与DNA分化背离.从现代地理分布看,具有交叉遗传组成特点的居群是相互隔离的,它们为什么会发生交叉以及如何交叉等进化生物学问题仍有待于研究.一种比较可能的途径是历史上杂交导致的叶绿体捕获.从进化-系统发育的物种概念出发,作为物种,首先必须是独立的进化谱系,遗传分化的大小为分类处理提供参考,而不是唯一依据.考虑到叶绿体基因组的遗传特点,认为核基因组的GPAT基因树更接近物种树.因此,矮牡丹与卵叶牡丹、牡丹+中原牡丹与杨山牡丹虽然遗传分化不大,但却是独立的进化线,可以作为不同的物种,而紫斑牡丹和四川牡丹的一些居群之间虽然叶绿体基因的差异较大,但并没有分化成独立的进化谱系,把它们看成同一物种的不同地理宗更符合实际情况.Hong和Pan在发表中原牡丹时并没有提及中原牡丹与牡丹(栽培)的关系,但在较早的文献中认为现属于中原牡丹的河南嵩县成分为牡丹的野生近亲.中原牡丹能否成立取决于对(栽培)牡丹范围的限定以及能否澄清(栽培)牡丹实际上代表哪个(些)栽培品种,目前的研究结果还不足以对此做出明确的判断.3.2形态特征的差异牡丹组物种之间相互区别的性状并不多,主要有新枝花朵数目、心皮数目与毛被、花盘包被心皮的程度与颜色等,这些性状差异主要存在于两个亚组之间.Zhou等人用形态学性状进行了牡丹组的系统发育分析,结果显示肉质花盘亚组是个并系类群,这与本文的结果不同.亚组内物种之间的形态差异主要是数量性状,特别是复叶的形态和花部的颜色.在革质花盘亚组内,形态的相似性与遗传相似性也存在一定的背离.从形态上看,物种似乎是逐渐分化的过程,而从GPAT基因看,两条进化谱系的分化十分清楚.产生这种差异的原因是形态特征分析时大量的微小数量性状差异淹没了具有显著系统发育意义的特征,如复叶小叶的数目、花盘的形态等.同样,形态特征的差异与叶绿体基因的分化也显然不同.叶绿体基因表现出多条独立的进化线,但形态特征看不出这种关系.叶绿体基因谱系和形态特征差异之间的不吻合可能是由于叶绿体基因与核基因对形态特征的贡献不同,因为形态特征主要由核基因控制,具有相近核基因组成的居群或物种就表现出相似的形态特征.3.3位点变异对总变异贡献率及精密度的响应在物种的鉴别中,可使用的特征越多,鉴别就越容易、越准确.应用形态特征最大的困难之一就是可使用的性状少,特别在低分类等级,往往只有数量性状上的差异,而分子标记可供选择的余地很大.本实验使用的叶绿体基因组4个基因的序列有96个变异位点,其中信息位点69个.在GPAT中,变异位点有279个,其中信息位点148个.与形态性状相比,分子标记性状显然丰富得多.与信息位点相关的是信息位点的分布规律.如果信息位点差异不是来自物种之间,而是来自物种之内,且随机分布(如Taq酶带来的误差),再多的位点也不能正确区分物种.在牡丹组内,亚组间位点变异对总变异的贡献率是亚组内两倍以上,说明亚组间的分化显著,亚组的划分确实反映了遗传分化的程度.在亚组内、种或居群系统之间位点差异的贡献率是种或居群系统内位点差异的贡献率的两倍以上,说明这些位点能很好地区分这些物种或居群系统(表3).分子标记的总体效果并不等于对每个物种都有同样的分辨率,理想的分子标记应能区分所有的物种.然而,物种的分化是个逐步的过程.有的物种在几百万甚至上千万年前就已经分化出来,DNA序列上的差异会很大;而有的物种间分化开来的时间却只有几十万年甚至更短的时间,还没有足够的时间积累遗传变异,或者遗传变异还没有经受足够长时间的自然选择,物种间DNA序列差异小,或者说序列的区分能力差.植物中总有一些物种与其他同属的物种分化明显,而另一些物种无论形态上还是DNA序列上的分化都相对较小.在牡丹组12个种或居群系统中,种或居群系统之间完全分化的位点存在差异(表2).从叶绿体基因看,属于四川牡丹的马尔康居群与同物种的理县和茂县居群差异明显,但与紫斑牡丹的东部居群、矮牡丹以及卵叶牡丹的叶绿体基因差异较小.茂县和相邻的理县居群有10个完全分化的位点,但与紫斑牡丹的西部居群却几乎没有分化.考虑到茂县居群与紫斑牡丹的西部居群在GPAT基因上同样没有差别,尽管形态上两者有所不同,它们应属于同一物种,为紫斑牡丹的一种类型.DNA条形码技术的实际应用不可能象本文这样采用大量的基因,甚至采用技术上非常困难的GPAT基因.但只有当物种范围的限定及其相互关系牢固地建立在可靠的系统发育分析基础之上DNA条形码才能准确鉴别物种.因此,类群的系统发育分析应该成为DNA条形码技术的前提和基础.3.4dna条码鉴别的可行性DNA条形码分析的初衷是用最简单易行的方法鉴定物种.然而生物界的复杂性使人们难以找到一种适用于所有类群的分子标记,必须根据不同的类群设计不同的分子标记.另外,单一标记,不论是来自叶绿体基因组、线粒体基因组,