黄芪多糖的提取及分离纯化研究

黄芪多糖的提取及分离纯化研究

中药黄是豆科植物膜中黄鼠尾和蒙古黄鼠尾的干燥根。具有益中、调阳、固外、托毒、舒肌、利尿、止泻的功效。主要理学成分为茶多酚、糖苷、黄酮、各种氨基酸和微量元素。黄芪多糖是黄芪的有效成分之一,是从黄芪根中得到的一类大分子活性物质。现代药理学研究表明,黄芪多糖具有抗衰老、抗过氧化、增强免疫功能、改善心血管功能、抗肿瘤等作用,能增加机体的非特异性抵抗能力,临床常用作免疫增强剂。临床上多用水直接煎煮法提取黄芪多糖,但收率和纯度均较低,为了更好地开发和利用黄芪多糖,对其提取和纯化工艺进行了进一步的研究。1材料和方法1.1仪器、试剂和仪器壳聚糖(青岛海得贝生物工程有限公司),Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂(天津正天成澄清技术有限公司),UV2102PCS紫外分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司),AUW220D电子分析天平(日本岛津公司),DZF-2型真空干燥箱(北京市光明医疗仪器厂),所用试剂均为分析纯。黄芪药材(购于河南省药材公司),经河南中医学院董诚明教授鉴定,为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。1.2提取医疗用品的方法1.2.1黄芪多糖的提取取黄芪药材800g,分别加12倍、10倍水煎煮2次,抽滤,合并2次滤液,减压浓缩至800mL,从中取出200mL加适量95%乙醇,使最终含醇量为80%,过夜,抽滤,沉淀依次用丙酮、无水乙醇洗涤,得黄芪多糖粗品。1.2.2黄芪多糖的提取取黄芪药材400g,分别加12倍、10倍量用NaOH调pH为12的碱水煎煮2次,抽滤,合并2次滤液,调pH值为中性,减压浓缩至400mL,从中取出200mL加适量95%乙醇使最终含醇量为80%,过夜,抽滤,沉淀依次用丙酮、无水乙醇洗涤,得黄芪多糖粗品。1.2.3黄芪多糖的提取取黄芪药材200g,分别加12倍、10倍量用CaO调pH为12的碱水煎煮2次,抽滤,合并2次滤液,调pH值为中性,减压浓缩至200mL,然后加适量95%乙醇,使最终含醇量为80%,过夜,抽滤,沉淀依次用丙酮、无水乙醇洗涤,得黄芪多糖粗品。1.2.4黄芪多糖的提取取黄芪药材200g,分别加12倍、10倍量用NaOH调pH为12的含5%乙醇的碱醇回流提取2次,抽滤,合并2次滤液,调pH值为中性,减压浓缩至200mL,然后加适量95%乙醇,使最终含醇量为80%,过夜,抽滤,沉淀依次用丙酮、无水乙醇洗涤,得黄芪多糖粗品。1.2.5黄芪多糖的提取取黄芪药材200g,分别加12倍、10倍量用CaO调pH为12的含5%乙醇的碱醇回流提取2次,抽滤,合并2次滤液,调pH值为中性,减压浓缩至200mL,然后加适量95%乙醇,使最终含醇量为80%,过夜,抽滤,沉淀依次用丙酮、无水乙醇洗涤,得黄芪多糖粗品。1.3纯度方法1.3.1皮聚糖悬浮剂的制备称取1g壳聚糖,用100mL1%的醋酸水溶液加热搅拌进行溶解,即得100mL1%的壳聚糖絮凝剂。1.3.21天然清算剂zec1A组分:用蒸馏水配成体积分数1%的溶液50mL;B组分:用1%的乙酸配成体积分数1%的溶液50mL。1.3.3黄芪多糖的纯化取200mL水提得到的黄芪多糖溶液,用NaOH调pH到10.54,静置过夜,抽滤除去沉淀,同时把下层滤液用10%硫酸调pH值为5.44,静置过夜,过滤,加适量95%乙醇,使最终含醇量达到80%,静置过夜,抽滤,沉淀依次用丙酮、无水乙醇洗涤,得初步纯化后的黄芪多糖。1.3.4壳聚糖絮凝后黄芪多糖的制备取200mL水提得到的黄芪多糖溶液,按黄芪多糖浓缩液体积的20%加入壳聚糖絮凝剂,搅拌20min后静置40min,抽滤得到滤液,然后加适量95%乙醇,使最终含醇量为80%,过夜,抽滤,沉淀依次用丙酮、无水乙醇洗涤,减压干燥得到壳聚糖絮凝除杂后的黄芪多糖。1.3.5提取多糖、干燥多糖将壳聚糖絮凝除杂后的黄芪多糖80℃水浴2h后,先加入B组分,每30min搅拌1次,2h后加入A组分,1h后搅拌1次,2h取出,离心10min(3000r/min),上清液加适量95%乙醇,使含醇量达到80%,静置过夜,沉淀用丙酮、无水乙醇洗涤数次,减压干燥得到多糖。1.4黄棕榈糖含量1.4.1葡萄糖溶液的制备精密称取干燥至恒定质量的葡萄糖标准品0.10007g,定溶于1000mL容量瓶中,即得葡萄糖标液。1.4.2hco30.5%馏分溶液取苯酚100g,加铝片0.1g和NaHCO30.05g,蒸馏,收集182℃馏分,称取5.0g,定溶于100mL棕色容量瓶中,冰箱内冷藏备用。1.4.3标准曲线的绘制分别精密移取葡萄糖标液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL置于10mL容量瓶中,补充水分至1mL,然后分别加5%苯酚溶液1mL,浓硫酸5mL,迅速振摇,水浴锅中100℃保温20min,取出后放至室温,同时做一空白对照,于490nm处测定吸收度,绘制标准曲线,得回归方程:A=0.008731C+0.008200,r=0.9992。1.4.4苯酚含量测定分别将提取得到的黄芪多糖,置放于有P2O5的真空干燥箱中,减压干燥至恒定质量,再分别从中精密称取0.05g,定溶于500mL容量瓶中,然后分别从中精密移取0.5mL至10mL容量瓶中,补充水分至1mL,再分别加入5%苯酚溶液1mL,然后迅速滴加浓硫酸5mL,充分振摇,水浴锅中100℃保温20min,取出放至室温,同时做一空白对照,于490nm处测定吸收度,代入标准曲线A=0.008731C+0.008200,r=0.9992,计算含量。2种提取方法的提取效果及样品测定从表1可以看出,NaOH醇提醇沉的提取法所得多糖量、多糖纯度、多糖收率都高于其他4种提取方法;水提Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂除杂的纯化方法所得多糖纯度最高,但多糖量及多糖收率相对较低。3不同提取方法多糖提取效率1)从提取方法来看,碱醇提醇沉的提取效率要明显高于直接水提。这是因为碱对植物细胞壁起到破壁作用,且在碱性条件下纤维之间的酯键易断裂而发生剥皮反应,使更多的多糖得以游离而被提取出来。醇的渗透作用较强,在碱与醇的共同作用下,增加了多糖渗透率,降低了多糖的残留量,因而达到了提高多糖提取效