胃痛消痞方对功能性消化不良大鼠血清及胃肠组织cckspp的影响

胃痛消痞方对功能性消化不良大鼠血清及胃肠组织cckspp的影响

近年来，对功能功能障碍（fd）发病机制的研究中发现了胃肠激素分泌障碍。胃肠激素是产生于胃肠道内分泌细胞与神经细胞的一种小分子肽类活性物质,有些还存在于中枢神经系统(又称脑肠肽)。其中包括胆囊收缩素(Cholecystokinin,CCK)与血管活性肠肽(Vasoactiveintestinalpeptide,VIP)。本研究观察FD大鼠血清CCK、VIP的含量及两者在胃肠组织中的表达情况,探讨胃肠激素的紊乱对FD的影响。此外,较多FD患者伴有精神心理障碍。本文从中医角度,制造肝郁脾虚型模型大鼠,研究胃痛消痞方对肝郁脾虚型FD大鼠CCK、VIP的影响,进而为FD的治疗措施提供依据。1实验材料1.1sysk辽健康SPF级Wistar大鼠40只,雄性,12周龄,体质量250~280g,由中国医科大学实验动物中心提供[动物使用许可证号SYSK(辽)2010-008]。1.2向三九医药有限公司提供胃痛消痞方免煎颗粒(由柴胡、白芍、延胡索、白术、党参、砂仁、枳实、焦山楂、炒麦芽、炒鸡内金、炙甘草组成)由华润三九医药股份有限公司提供;西沙必利由西安杨森制药有限公司提供。1.3试剂盒和试剂盒CCK、VIP酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒由美国RD公司提供;CCK、VIP抗体由北京博奥森生物技术有限公司提供,SP免疫组化染色试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。1.4光学显微镜检测ELx808吸收光酶标仪、D-37520、Heraeus高速冷冻离心机、DNP-9162电热恒温培养箱、TB-718D生物组织自动包埋机、Mettler-ToleDOAL104型电子天平、TK-218型恒温摊片烤片机、ZT-12M生物组织自动脱水机、MicromHM340E半自动轮转切片机、NIKONE800光学显微镜。2方法2.1动物组40只大鼠随机分为4组:正常对照组、模型组、西沙必利组、胃痛消痞方组,每组10只。2.2破皮刺激试验除正常对照组外,其余3组均采用夹尾刺激法制造FD肝郁脾虚模型。方法:每日用长海绵镊子钳夹大鼠尾巴末端1/3处,以令其尖叫挣扎但不破皮为度(如有抓伤破皮,则用0.5%碘伏消毒受伤部位,以防感染),使其暴怒并和其他大鼠厮打,每次持续30min,2次/d,连续刺激3周。造模期间,各组大鼠自由进食及饮水。经夹尾刺激后的大鼠,与正常对照组比较,出现进食量减少,体形渐瘦,溏便,毛发变暗、枯黄、不顺,易怒,常互相嘶咬,并有紧张、焦虑状态,提示造模成功。2.3对大鼠血清学指标的影响于夹尾刺激法第3周后给予药物灌胃,用蒸馏水将胃痛消痞方、西沙必利分别制成1.125g/mL、0.25mg/mL的混悬液,根据人鼠给药剂量换算公式:dB=dARB/RA(WA/WB)1/3,胃痛消痞方组、西沙必利组分别每日给予胃痛消痞方9g/kg、西沙必利2mg/kg,模型组及正常对照组给予等量蒸馏水1次/d灌胃,持续3周。2.4ELISA法检测血清CCK、VIP含量给药21d后,禁食不禁水24h,10%水合氯醛(3.0mL/kg)麻醉全部大鼠,大鼠心脏取血约3mL,室温下血液自然凝固20min后,4℃离心(3500r/min,20min),收集上清分装于EP管中,置-20℃冻存待测。检测按CCK、VIP试剂盒说明书严格操作。2.5cck、hpv免疫取血结束后,立即取约1cm×1cm的胃窦组织及十二指肠组织(幽门下2cm处)全层各1块,置于4%多聚甲醛中固定。指标检测采用SP免疫组化法,方法:4%多聚甲醛中固定72h后,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,制成5μm厚的组织切片,常规脱蜡至水;用3%H2O2去离子水室温孵育10min,以消除内源性过氧化物酶活性,PBS冲洗3次;将切片浸入0.01M柠檬酸钠缓冲液(pH6.0),在微波炉里加热至沸腾后断电,5min后取出至室温冷却,PBS冲洗;滴加封闭用正常山羊血清工作液,室温孵育20min,甩出多余液体;滴加适当比例稀释的一抗(分别为兔抗大鼠CCK抗体和兔抗大鼠VIP抗体),4℃冰箱过夜;PBS洗3次,3min/次;滴加生物素化山羊抗兔IgG,室温孵育20min;PBS洗3次,3min/次;滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温孵育20min;PBS洗3次,3min/次;DAB显色10min(在显微镜下观察染色程度控制染色时间);自来水轻轻冲洗,苏木素轻度复染1min,水冲洗;脱水,透明,封片。显微镜观察,胞浆内CCK、VIP阳性产物呈深黄色或棕黄色者为强阳性,黄色为阳性,浅黄色为弱阳性,与背景同色者为阴性。每次实验同时,用PBS取代CCK、VIP抗体血清做空白对照,染色结果均为阴性。用光学显微镜(10×40倍)观察胃组织中CCK、VIP免疫阳性纤维分布。每张切片随机选取5个无重叠400倍高倍视野,应用NIS-ElementsF2.30图像采集软件进行图像采集,NIS-ElementsBR3.0图像分析软件测定胃组织中CCK、VIP阳性纤维的平均灰度值(分别代表CCK、VIP含量),灰度值越大,表示CCK、VIP含量越多。2.6统计方法应用SPSS16.0软件,各指标用表示,均数比较采用单因素方差分析(ANO-VA),P<0.05为差异有统计学意义。3结果3.1正常对照组组模型组血清CCK含量、胃肠组织CCK阳性纤维表达均低于正常对照组;各治疗组CCK高于模型组,胃痛消痞方组CCK高于西沙必利组(血清P<0.05,胃肠组织P<0.01)。见表1。3.2正常对照组与正常对照组纤维表达比较模型组血清VIP含量、胃肠组织VIP阳性纤维表达均高于正常对照组;各治疗组VIP均低于模型组,胃痛消痞方组VIP低于西沙必利组(P<0.01)。见表2。4治“胃”—讨论祖国医学将FD归属于“痞满”、“胃脘痛”等范畴,认为FD病位在胃,与脾肝相关。由于抑郁恼怒,情志不遂,导致肝气郁滞,失于疏泄,横逆乘脾犯胃,脾胃升降失常,发为痞满。如《景岳全书》言:“怒气暴伤,肝气未平而痞”。又如《血证论》所言:“木之性主于疏泄,食气入胃,全赖肝木之气以疏泄”。叶天士也云:“肝为起病之源,胃为传病之所。”可见肝脏在该病发病中起着重要的作用。临床研究表明,FD患者中医辨证属肝郁脾虚型者居多,故胃痛消痞方以此为出发点,由柴胡、白芍、延胡索、白术、党参、砂仁、枳实、焦山楂、炒麦芽、炒鸡内金、炙甘草11味中药组成。柴胡疏肝解郁,使肝气条达,为顾肝用;白芍酸敛肝阴,养血柔肝,为顾肝体,且配延胡索,共奏止痛之功;党参甘平补气,白术被前人誉为“脾脏补气健脾第一要药”,专入脾胃二经,甘温而兼苦燥之性,甘温补气,苦燥健脾,培其本而强其运;枳实、砂仁理气和胃,顺其和降之性;砂仁、白术还可化湿,可防脾虚生湿,有“抢占先机”之妙;焦山楂、炒麦芽、炒鸡内金消食化滞;炙甘草调和诸药。诸药合用共奏疏肝理气、和胃健脾之功,亦符合叶天士所强调:“凡醒胃必先制肝。”恢复肝的疏泄功能,肝气疏泄条达,则胃不受侮而胃气通降,木郁、土壅得以疏解,全身气机调畅,出入升降有序。此外,结合FD患者多有紧张、焦虚,治疗脾胃病时,重视情志因素的作用,体现了中医学的整体观念,正如《景岳全书》云“:若思郁不解致病者,非得情舒愿遂,多难取效”。现代医学认为,FD与胃肠激素紊乱密切相关,而胃肠激素可以通过迷走神经介导,在中枢和外周水平上对胃运动和胃排空进行精细调节,故胃肠激素对胃肠运动功能起重要的调节作用。目前认为可能与FD有关的胃肠激素有CCK、VIP等。CCK是由小肠的I细胞合成分泌的多肽激素,主要刺激胰酶分泌与合成,增强胰碳酸氢盐分泌和胃排空,刺激胆囊收缩与奥狄氏括约肌松弛,还可兴奋肝胆汁分泌,调节小肠、结肠运动,也可作为饱感因素调节摄食。有报道,餐后FD组血浆CCK测定值明显低于健康对照组(P<0.001)。本研究亦提示CCK分泌水平下降可能与FD发病有关。但也有外国学者认为,CCK可以抑制胃动力及胃排空,FD发病与CCK分泌水平升高有关。故CCK与FD的关系仍需进一步探明。胃运动及排空主要由肠神经系统(Entericnervoussystem,ENS)调节,通过神经递质发挥其作用,而VIP存在于ENS中,作为一种抑制性神经递质,对胃运动和排空具有抑制作用