烟草硝酸还原酶的激活与抑制作用

烟草硝酸还原酶的激活与抑制作用

亚硝酸盐是许多植物的主要氮来源。硝酸根离子在硝酸还原酶作用下,经硝酸还原过程先转变为氨,再与碳水化合物化合形成各种氨基酸,构成植物体的各种含氮组分。由植物同化的硝酸盐大约是2×1013?kg/a,比生物固氮的速率大100倍。因此,硝酸盐的同化作用在植物氮代谢中具有重要的意义。植物中硝酸盐转化为氨先是硝酸盐获得电子还原成亚硝酸盐,再由硝酸还原酶催化。NR是这个过程的起始酶,也是限速酶,在植物氮素代谢中处于关键地位。烟草中含氮化合物(蛋白质、游离氨基酸、烟碱和硝酸盐等)对烟草的质量和吸烟者的健康都有重要的影响。因此,研究烟草中NR具有重要的理论意义和应用价值。1材料和方法1.1tps-ms/ms法磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硝酸钾、亚硝酸钠、EDTA、磺胺、1-萘胺、盐酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等均为分析纯;去离子水,半胱氨酸,NADH为生化试剂。721分光光度计,pHS-2C酸度计,FA1104电子天平,各种规格Finnpipette可调式移液器;SHZ-D水循环式真空泵,HH-S型水浴锅,多功能食物搅拌器,冷冻离心机,超声波清洗器以及常规化学分析用玻璃仪器。1.2实验方法和步骤1.2.1制定标准no2曲线按照文献提供的方法进行。1.2.2酶液的制备和分离除诱导NR活性实验外,其余实验所用粗酶液按下述方法制备:取移栽30d(研究不同叶龄NR活性实验除外)后的烟苗倒数第3片完全展开叶,先用自来水冲洗,滤纸吸干后,分别用纯净水、去离子水淋洗,再用滤纸吸干,用不锈钢剪刀剪成小块,加入pH值8.5的50mmol/L磷酸盐缓冲液(内含5mmol/LEDTA和10mmol/L半胱氨酸),匀浆后在超声波仪上处理5min(冰浴),然后置于6层纱布过滤,滤液在4000r/min条件下离心15min,弃沉淀,所得滤液即为酶液,立即使用。1.2.3nr活力测定取12支试管,分别加入pH值5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0浓度0.05mol/L磷酸盐缓冲液2.0ml,浓度0.2mol/L?KNO3溶液0.5ml和浓度0.2mol/L?NADH1滴,酶液0.1ml,水浴锅上25℃保温30min,然后向每支试管加入浓度1%磺胺和0.2%1-萘胺各1.0ml,摇匀,25℃保温30min,用721型分光光度计测定520nm波长下吸光度A,并从标准曲线上查到相应的NO2-含量,计算NR活力。NR活力以NO2-[μml/(g.h)]表示(比较时直接用吸光度表示)。每个水平设2个平行。1.2.4pv活力测定取10支试管,分别加入pH值7.0浓度0.05mol/L磷酸盐缓冲液2.0ml,浓度0.2mol/LKNO3溶液0.5ml,浓度0.2mol?NADH50μl,酶液0.1ml,再依次加入PVP100、120、140、160、180mg,水浴锅上25℃保温30min,然后按照上述方法测定与计算NR活力大小。实验设2个平行,结果取平均值。1.2.5kno3溶液活力测定取10支试管,分别加入pH值7.0浓度0.05mol/L磷酸盐缓冲液2.0ml/L,浓度0.2mol/LNADH50μl,酶液0.1ml,再加入KNO3溶液使KNO3溶液浓度分别为:10、30、50、73、90、100mmol/L,在水浴锅上25℃保温30min,用同样方法测定与计算NR活力大小。实验设2个平行。1.2.6nr活力测定取6支试管,分别加入pH值7.0浓度0.05mol/L磷酸盐缓冲液2.0ml,浓度0.2mol/LKNO3溶液0.5ml,酶液0.1ml,再依次加入NADH至浓度分别为0、0.010、0.020mg/ml,水浴锅上25℃保温30min,用同样方法测定与计算NR活力大小。实验设2个平行,平均值作为测定值。1.2.7相同植物叶片nr活力测定将烟叶采收后,插入浓度0.2mol/LKNO3溶液中,另一份插入去离子水中,作为对照。为避免光强度变化的影响,它们始终置于相同的日光灯下。分别经1、2、3、4、5、6h诱导后,用前述方法制备粗酶液。再取0.1ml粗酶液加入到下列混合液中:pH值7.0浓度0.05mol/L磷酸盐缓冲液2.0ml,浓度0.2mol/LKNO3溶液0.5ml,浓度0.2mol/L?NADH1滴,水浴锅上25℃保温30min,用同样方法测定与计算NR活力大小。实验设2个平行。1.2.8不同叶间隔内的ri活力研究分别取移栽后20、30、50天叶龄的烟苗,对其NR的活力按前述方法进行测定。2结果与讨论2.1ph值对nr活性的影响图1显示,从pH值5.5开始,随着pH值的增加,NR活性随之增加。pH值7.0时,活力达到最高,其后随着pH值的增加,活性反而降低。2.2pv用量对nr活力的影响(图2)实验结果表明,PVP有明显保护酶活力的作用,在实验范围内,NR活力是随着PVP用量的增加而不断增加的。但当浓度达到80mg/ml后,效果不明显。另外,将这一实验结果用于NR的提取与纯化时发现,PVP用量较高时,会使提取液变得粘稠,不利于搅拌、过滤等操作。2.3kno3浓度对nr活性的影响图3KNO3是NR作用的直接底物,它对酶的活力有显著的影响。在实验范围内,这种影响不符合米氏方程。2.4nadh对nr活性的影响(图4)NADH是烟草NR的辅基,在NR对KNO3进行还原的酶促反应中,起着提供电子的作用,从这一点看,似乎NADH始终对NR的活力有促进作用。但研究结果表明,NADH浓度较高时,反而抑制NR的活性。Solomonson认为,在NO3-还原为NO2-时,NR活性中心的M04+被氧化为M06+,然后可能通过电子传递再使M06+还原为M04+。在过多NADH存在下,含钼活性中心可能被还原为不能参与NO3-还原的稳定的M03+,因而钝化了酶。2.5kno3对烟草nr活性的影响图5显示,在相同时间内,经KNO3诱导的烟叶中NR活性比未诱导烟叶高很多。未经诱导的烟叶NR活力在处理后4h达到最高值,而经过KNO3诱导的烟叶,其NR活力在处理后2h就已达到最大值,这也表明,经过KNO3诱导,使得酶活性的滞后期有所提前。在酶活性达到最大值后,NR活力开始衰减,但衰减的速率不一样。未经KNO3诱导的烟叶NR活力衰减速率约是经诱导烟叶的2倍。2.6影响nr活性的因素(图6)高等植物(包括烟草)的NR活性受多种因子的调节,除了酶的合成和降解外,稳定因子和NR的失活蛋白都能调节NR的活性。由于