木霉菌株长枝木霉对烟草黑胫病菌的拮抗作用

木霉菌株长枝木霉对烟草黑胫病菌的拮抗作用

1896年，bruda在印度尼西亚的混合草上发现了一种土壤传统病。这种疾病通常发生在我国的广泛杂草植物区。它通常导致草坪的小肿胀、草坪的变红、叶片的变黄、根和茎的基部坏死，严重损失达到50%。现在，在生产中，抗病品种、栽培防治和综合防治等综合防治措施通常用于综合防治。同时，由于病原体的运动速度快、量大、扎草后适应性短、发病快，在一个生长季节会出现多次斑点。同时，这种疾病有时与其他疾病混合，导致某些抗黑胫骨病品种的抗性丧失。化学防治中的抗虫性农药的使用是暂时有效的，但长期使用后会导致植物植株、植物叶片和农药残留以及对农药的抗药性。防治和控制是控制国际植物病害的首选措施。这种从自然界中分离出来的有害微生物的防控和抑制，是一种高效、无残留、低效的针灸和艾灸。近年来，随着卷烟和卷烟产品的快速安全发展，一些卷烟和香烟产品的安全性已引起人们的注意。在本研究中，选择了患有黑棕色斑点的稻草古菌，测定和研究了室内和室外昆虫的对抗机制、室内和室外昆虫的对抗效果。1材料和方法1.1试验中的蘑菇1.1.1黑胫骨病的菌株见表19株烟草黑胫病菌分别分离自云南省不同烤烟种植区的烟株病茎.1.1.2木霉素1株木霉菌株(TrichodermalongibrachiatumRifai)采用诱捕法从土壤中分离筛选得到.1.2烟草黑测定病原菌生长情况观察制备PDA和燕麦培养基平板,采用对峙培养将上述木霉菌株(T.longibrachiatum)分别与烟草黑胫病菌菌株接种在相对的平板边缘,28℃恒温培养,连续观察菌落的生长情况及菌落的相互影响.1.3重复生动功能的测定挑起上述对峙培养菌落交界处的菌丝块,于普通光学显微镜下观察.1.4抗抑郁药1.4.1病原菌的生长和木霉的抑制作用将上述9个分离自不同地区的烟草黑胫病菌株和已筛选分离的1个木霉菌株分别在PDA平板上(25℃)培养生长3d后,再对峙培养,即分别挑取新鲜培养的9种病菌菌丝(大小约4mm2)放在PDA平板一侧的中间,同时在相对一侧的中间放置同样大小的木霉菌丝块,两者相距1.5cm,每株病菌分别与该木霉菌株配对,置于25℃恒温培养箱内培养,逐日观察菌落的生长和木霉的抑制作用,连续观察7～10d.1.4.2抗生素测定1.4.2.tr14、tr17的制备于盛有40mLPDA培养基的三角瓶中,分别移接TR13,TR14和TR17,室温下摇床150r/min培养.5d后取下,真空抽滤.取滤液过滤灭菌(孔径0.22μm).滤液经PDA平板培养,证明无菌后置4℃冰箱冷藏备用.1.4.2.2.非刺激性抗菌试验用圆孔滤液法和游动孢子萌发法检测.1.4.2.菌落抑菌率测定于直径9cm的培养皿皿底加入10～15mL燕麦培养基待凝成平板,皿盖中心加入5～6mLPDA待凝成薄层.于皿盖中心接种木霉菌的0.5cm直径圆片,皿底中心接种同样大小的烟草疫霉菌片,28℃恒温倒置培养.另设不接木霉菌作对照.1周后取出检查黑胫病菌菌落的扩展情况,测定菌落直径,按下列公式计算抑菌率:对照菌抑菌率=(落扩展直径-处理菌落扩展直径对照菌落扩展直径)×100%1.5水解酶活性测定平板活性检测1.5.1-1，3葡萄糖酶活性测定参照杨合同的方法(木霉菌(Trichodermaspp.)代谢产物的分析,植病学会华北分会第六届年会论文摘要集,1991).1.5.2柠柠檬酸钠/硫酸镁控制系统配制纤维素培养基:1g硫酸铵;7g磷酸氢二钾;3g磷酸二氢钾;0.5g柠檬酸钠;0.1g硫酸镁;5g纤维素;15～20g琼脂;1000mL蒸馏水.灭菌后制平板,接种木霉菌,28℃恒温培养3～4d,加入碘氯化锌试剂,观察透明圈的有无及大小.1.6家庭游泳池测试1.6.1烟草黑适应证病防治选择生长势大小相同,苗龄40d的烟苗(红大),移栽.缓苗10d后,采用灌根接种法,将配制好的木霉分生孢子悬浮液(107个/mL)均匀接种烟苗根部营养土.2d后,灌根接种烟草疫霉游动孢子悬浮液(105个/mL),并分别设只接种烟草黑胫病菌和清水的对照组,重复5次.采用俞大绂对烟草黑胫病的分级标准,计算病情指数与相对防效,统计分析.1.6.2采用木制霉浓度法确定抗虫性将木霉菌培养后,分别配制成108,107,106个/mL3种浓度级的孢子悬浮液,按照1.4.1的方法测定其对病菌的相对防效.1.7验证空间1.7.1病害处理与分级试验地点在省烟院农业所,设4个处理,1个对照.处理1:每株烟(红大)施菌剂2g;处理2:每株烟施菌剂3g;处理3:每株烟施菌剂4g;处理4:1∶1000倍甲霜灵浇施2次,每株施100mL;对照:不施药.每个处理3次重复,田间顺序排列,2000年5月19日移栽,每小区1行,栽烟21株,株行距为110cm×60cm,千株烟施氮8.6kg,m(氮)∶m(磷)∶m(钾)=1∶1∶2.5,处理1,2,3于移栽时将药剂直接施于根周围,处理4于移栽后4d浇施第1次,移栽后14d浇施第2次.移栽后16d接烟草黑胫病菌谷,每株5g,接种后灌半沟水保湿.分别于6月22日、7月27日、8月15日进行病情调查,以最后一次的调查结果进行统计分析.病害分级标准按国家行业标准YC/T39-1996规定执行,病情分级标准如下:0级:全株无病;1级:茎部病斑不超过茎围的1/2或1/2以下,叶轻度凋萎,或下部少数叶片出现病斑;2级:茎部病斑超过茎围的1/2或1/2以上叶片凋萎;3级:茎部病斑环绕茎围或2/3以上叶片凋萎;4级:病株全叶凋萎或枯死.1.7.2处理数据病指=∑(各级病株数×该病级值)调查总株数×最高级值×100%防效=对照病指-处理病指对照病指×100%2结果2.1不同培养菌落木霉菌的能力在PDA培养基上,该木霉菌的生长速度是所有黑胫病菌平均生长速度的4～7倍,说明木霉菌具有良好的营养竞争能力,与对照黑胫病菌的纯培养菌落相比较,木霉菌对病菌有抑制作用;在适合病菌生长的燕麦琼脂培养基上,该木霉生长相对缓慢,但同样表现出对病菌有抑制作用.2.2重复生动功能的测定木霉菌株的菌丝在显微镜下观察可附着并缠绕在病菌菌丝上,该菌株可寄生黑胫病菌.2.3抗抑郁药2.3.1抗菌圈的观察从该木霉与黑胫病菌的对峙培养结果看(见图1,图2),木霉菌株的拮抗作用表现为产生抑菌圈,抑制病菌菌丝的生长.2.3.2抗生素测定(1)木霉菌对黑髂病菌生长的影响①圆孔滤液法实验结果:CK(对照)、木霉菌株在实验中均不产生抑菌圈,病菌长满全皿,结果表明:该木霉产生的非挥发性抗生素抑制黑胫病菌菌丝的生长.②游动孢子萌发实验结果:木霉菌菌株处理与对照(萌发率为71%)相比,萌发率为34%;对芽管长度的作用,对照芽管长度为2.82μm,处理为0.82μm,表明木霉菌可产生非挥发性抗生素抑制病菌孢子的萌发并抑制游动孢子芽管的伸长.(2)木霉菌生长结果对照(CK)中,病菌单独接种的菌落长满培养皿(菌落直径9.0cm),该木霉菌粗提液处理后的病菌菌落较小(直径为3.0cm),菌丝层薄而稀疏,表明该菌明显产生挥发性抗生素抑制病菌气生菌丝的生长.2.4水解酶活性的测定2.4.1-1,3葡聚糖酶消解烟草黑适应证菌的表型该木霉菌菌落生长处蓝色消失,透明圈与菌落直径都为4.0cm.表明木霉菌菌株在平板培养过程中可产生β-1,3葡聚糖酶消解烟草黑胫病菌的细胞壁.2.4.2纤维素酶活性测定木霉菌菌株在菌落周围形成透明圈,但透明圈较小.表明该菌株可产生纤维素酶参与烟草黑胫病菌株的细胞壁的消解.2.5家庭游泳池测试2.5.1木霉菌对大鼠血清病情指数的影响从盆栽试验结果看,该木霉菌对黑胫病菌的防效较高,处理后病情指数仅为1.3,与对照相比,相对防效为97.6%.从病情指数的统计分析结果看,施用木霉菌的处理病情指数与对照相比,在α=0.05水平上显著;在α=0.01水平上达极显著.2.5.2/ml浓度选择木霉菌株的106,107,108?个/mL3个浓度级处理与烟草黑胫病菌对照组的差异在α=0.05水平上都达到显著,在α=0.01水平上达到极显著,而3个浓度级之间在α=0.05和α=0.01水平上都没有达到显著差异(表3),故从经济角度考虑,选择106个/mL浓度级比较理想.2.6施药后84d,土壤中2防效3防效4防效5.5%;从表4可知施药后69d,处理1防效为35.19,处理2防效为51.40,处理3防效为54.12,处理4防效为59.50;施药后88d,处理1防效为38.20,处理2防效为56.39,处理3防效为67.29,处理4防效为74.58;同时还可以看出,移栽时每株施木霉菌剂4g效果较好,其防治效果仅次于1000倍甲霜灵锰锌.用8月15日的调查结果进行方差分析,结果表明在0.05的水平上,各处理与对照达极显著差异,在0.01的水平上,处理1与对照差异不显著,处理2,3,4与对照差异显著.3木霉菌的抗菌作用木霉菌(Trichodermalongibrachiatum)对烟草黑胫病菌的拮抗机制初步认为是以下几方面的作用:(1)在生长竞争作用方面,在特定培养基上,该木霉菌的生长速度是烟草黑胫病菌生长速度的4～7倍,表明该木霉菌具较强的营养竞争能力,生长竞争力强.(2)在重寄生作用方面,该木霉菌的菌丝可附着并缠绕在病菌菌丝上,表明该菌株可寄生烟草黑胫病菌,具重寄生作用.(3)在拮抗作用方面,该木霉菌可产生β-1,3葡聚糖酶、纤维素酶消解病菌的细胞壁,同时还可产生非挥发性抗生素抑制病菌菌丝生长、孢子萌发、芽管伸长,产生挥发性抗生素抑制病菌气生菌丝的生长.据文献报道木霉在对病菌的拮抗、重寄生等过程中,几丁质酶起着重要作用.一方面,几丁质酶参与木霉对病菌的侵染过程,其产生的几丁质酶消解和杀死病菌,从而获得营养.另一方面,其产生的几丁质酶对病菌的孢子萌发、芽管伸长和菌丝生长有强烈抑制作用,具有直接的抗菌作用.近期内,有报道利用木霉产生的几丁质酶分解的几丁质寡糖诱导植物自身启动防御反应,使其产生植物保卫素(Phytoalexin),同时还能诱导植物几丁质酶活性的提高,从而达到抑杀病菌的作用.本次实验筛选的木霉菌株产生几丁质酶能力及其产生的生物活性物质有