蜂胶中黄酮类化合物的分离与鉴定

蜂胶中黄酮类化合物的分离与鉴定

蜂胶来自植物中所含的树胶和树脂物质。在对蜜蜂进行分类后，添加了具有蜡和蜜蜂上臂分泌物形成的棕色凝胶。这是蜂蜜最独特、最神奇的自然资源，被称为“紫金”。欧洲称蜂胶为“神奇的药物”、“上帝的恩赐”,亚洲称其为“天外之物”、“现代万能药”、“本世纪最伟大的天然药物”等。蜂胶为具有芳香气味的不透明胶状固体,颜色呈黄褐色或灰褐色,味微苦,不溶于水,溶于乙醚、乙醇等。1、聚酰胺类化合物蜂胶的化学成分研究始于德国。1910年Kustenmacher从蜂胶中鉴定出肉桂醇和肉桂酸。已在北温带地区的蜂胶中共鉴定出305个化合物,其中黄酮类化合物71个,芳香酸与芳香酸酯59个,氨基酸25个,醛与酮类化合物17个,脂肪酸与脂肪酸酯50个,萜类化合物19个,甾体化合物6个,糖类化合物9个,烃类化合物25个,醇、酚类和其他化合物24个(郭珈,2000)。古巴蜂胶乙醇提取物中一种新的聚异丙烯苯酮被分离出来,其对细菌和霉菌有显著的抗菌作用(RubioOC等,1999年)。巴西蜂胶的MeOH提物中发现新的异戊二烯基苯并二氢吡喃衍生物,3-羟基2,2-二甲基-8-异戊烯基苯并二氢吡喃-6-丙烯酸和22种已知成分,其中2,2-二甲基苯并吡喃-6-羧酸、4-羟基-3-异戊烯基肉桂酸、贝壳杉酸、贝壳杉酸-15-甲基酯、agathalic酸、柏油酸、山麻黄酮、槲寄生素酮、12-乙酸基槲寄生素酮、桦木醇、3,5,7-三氢-4-甲氧基黄烷酮等11种成分首次从蜂胶中分离出来(Banskoto等)。一种新的类黄酮化合物,杨梅黄酮-4,7,4’,5’-四甲基乙醚在突尼斯蜂胶中被首次发现(Martos等,1997)。从智利蜂胶中分离出3种新的木酚素,松叶素乙醇乙酸纤维素三聚体、松叶素乙醇乙酸纤维素二聚体的非对映体、二氢苯吡喃木酚素醛(Valcic,1998)。2、菌株病毒病毒层面国外许多学者对蜂胶的药效作用进行了大量实验,已经证明,蜂胶对细菌、真菌、病原、线虫有杀灭或抑制作用,包括幼虫芽孢杆菌、枯草杆菌、杆状菌、葡萄球菌、金黄色葡萄杆菌、链球菌、链霉菌、发面酵母、大肠杆菌、沙门氏菌、112种厌氧菌品系、贾第鞭毛虫Lambia,拟杆菌、克氏杆菌等细菌、白假丝酵母、黑曲霉、灰葡萄孢霉、蜜蜂球囊菌、6种人类传染的真菌等真菌、疱疹、马铃薯病毒、流行性感冒、新城疫等病毒以及蛔虫等(胡福良,1998)。金枝等(1999)测定了巴西蜂胶和中国蜂胶的LD50,认为蜂胶作为食品原料是安全的。2.1,4-二咖啡醇3,4-二咖啡醇-3,4-二咖啡醇3,4-二咖啡醇的色谱分析添加50mg/kg的蜂胶可以阻止使用扑热息痛造成的肝坏死过程,减少肝癌的发病几率(SharmaM,1998)。色谱分析发现,3,4-二咖啡醇癸尼酸酯盐和3,4-二咖啡醇癸尼酸酯的抗肝损伤能力比甘草素还要好(BasnetP,1996)。MahranL.C.等(1996)发现蜂胶水提物对四氯化碳造成的肝损伤有修复作用,其机制主要是通过阻止脂质氧化和调整体内的谷光甘肽的水平。2.2对人肺癌细胞的作用美国科学家等的研究表明,蜂胶的抗癌效果与服用剂量有关系,高浓度的蜂胶能抑制肿瘤(FrenkelK、Grunberger)。实验证明,0.2-1.0mg/ml蜂胶能抑制胰蛋白酶的蛋白质分解活性,但槲皮素、咖啡酸几乎没作用。0.25-2.0mg/ml蜂胶、槲皮素和咖啡酸能抑制多种蛋白酶的肽基MCA基质水解活性,0.25-2.0mg/ml的蜂胶有助于正常肝细胞增殖,促进因子(HGF)的活性化或是维持活性。40-200μg/ml的蜂胶能使人大肠癌细胞COLO201和人肺癌细胞LU65增殖明显受到抑制;在蜂胶浓度超过160μg/ml时,这些癌细胞的增殖受到完全抑制(船越崇行等,1998)。蜂胶通过抗氧化作用阻止癌变(KimotoT)。在蜂胶提取物对艾氏腹水癌细胞(Derevici&Popesco,1965;Derevici&soru,1972;Scheller,1989)抑制作用、不同溶剂制备的蜂胶提取物对人鼻咽癌和人宫颈癌细胞系的毒性作用(Hladov,1980)、蜂胶对偶氮色素诱发的大鼠肝癌的作用(松野哲也,1994)、蜂胶对由7,12-二甲基苯并蒽引起的小鼠皮肤良性乳头瘤的作用(Sakamoto,1994)、蜂胶的生物调整作用(安守纯子等,1993、1994;新井成之,1993;松野哲也,1994;新井成之,1994)国外学者已开展了研究。铃木郁功等(1996)研究了巴西蜂胶水溶物及其组分对小鼠艾氏腹水癌的抑制作用以及对白细胞和血小板的保护作用。在蜂胶的抗癌组分方面,也开展了大量的研究工作。松野哲也等(1992)发现蜂胶的细胞毒性是由其组分槲皮素、咖啡酸苯乙酯和蜂胶双萜所产生的。2.2.1绿假素和总黄酮的活性已被证明抗癌有效的12种黄酮类化合物中作为蜂胶成分的有7种(槲皮素、山奈素、高良姜素、芹菜素、木樨草素、蜜桔黄素和福桔黄素)(Middleton,1994)。某些黄酮化合物能抑制细胞增生,如木樨草素和槲皮素都具有抗增生活性,多氧基类黄酮福桔黄素和蜜桔黄素也具有抗癌活性(Middleton,1994)。某些黄酮化合物(包括蜂胶中含有的福桔黄素)的抗转移活性已得到证实(Bracke,1988)。Ban等(1983)观察到蜂胶对Hela细胞有杀灭作用,其中Hela细胞对槲皮素和鼠李素较敏感,对高良姜素的敏感性差。采食含5%槲皮素饲粮的大鼠对7,12-二甲基苯并蒽引起的乳腺肿瘤的发病率低(Werma,1988)。离体实验证明,槲皮素等四种黄酮类化合物能诱导哺乳动物拓扑异构酶Ⅱ依赖型DNA的断裂(Yamashita,1990)。2.2.2细胞毒性对黑素肺癌的作用Grunberger(1988)证明从以色列蜂胶中分离的咖啡酸苯乙酯对肿瘤细胞具有特定的细胞毒性,其对黑素癌(SK-MEL-28和SK-MEL-170)、结肠癌(HT-29)和肾癌细胞系的作用极为强烈。Guarini测定了咖啡酸苯乙酯对人体黑色素瘤HO-1及多形性皮胶质细胞瘤GBM-18细胞系的影响。2.2.3萘Rose(1990)报道了用动物体外实验蜂胶对中国仓鼠卵巢癌细胞系的细胞毒性作用是由于蜂胶中有萘的衍生物的存在。2.2.4tepllinc的设计木本哲夫等(1995)从巴西蜂胶中分离出有抗癌作用的ArtepillinC,实验证明对癌细胞的抑制作用和对大鼠移植肿瘤细胞的抗癌作用,开发出ArtepillinC的水溶性钠盐作为化学疗法辅助药,可供静脉注射治疗白血病。2.3蜂胶和溃疡SatoT研究表明,蜂胶不仅可以抑制胃溃疡,而且可以抑制尿素酶的作用。2.4蜂胶和降低血压TakeyukiI研究证明,蜂胶中的芳香物质可以在20分钟内降低4-5%的血压。3、两种提取方法的比较国外用于药品和食品的蜂胶,几乎全部采用和蜂胶的提取方法基本上可分为醇溶和水溶两种。醇溶包括蜂胶的乙醇提取液、乙醇提取物的快速提取、甘醇提取法、油提取法、蜂胶软膏、干提取物、水溶性蜂胶的干粉状蜂胶提取物、自由流动和不吸湿的蜂胶粉、水溶性的衍生物。YongKunPark采用紫外分光光度计法比较了水溶蜂胶液和乙醇溶解蜂胶液的吸收光谱,二者虽然在290nm处均为最高峰,但水溶蜂胶液的吸收水平却很低。60%的乙醇液提取的蜂胶液中所含异樱花素、槲皮素、山奈酚的量最高,70%乙醇液提取的乔松素、樱花素量最多,80%的乙醇液提取的山奈甲黄素、刺槐素、异鼠李素较多。60%和80%乙醇提取液对微生物的抑制作用最强,70%和80%的乙醇提取液的抗氧化作用最强,80%的乙醇提取液对透明质酸酶的抑制作用强,而蜂胶水溶液不能抑制微生物生长和透明质酸酶活动,抗氧化性能较弱。日本采用硼高分子电解质法提取蜂胶。将阴离子型高分子化合物—硼高分子电解物的稀释精制水溶液与含有蜂胶物的纤维素充分混溶,高分子电解物的稀释精制水溶液可不断分解蜂胶,然后加入乙醇和以海藻为原料的纤维素,从而可提取出含有有效成分的亲水性凝胶体,经提炼后的结晶具有很强的除菌力,用这种方法得到的提取物具有很好的活性。4、解决艾美球虫病的应用蜂胶或蜂胶提取物在医药上用作过敏原、抗辐射、抗肿瘤、治疗溃疡、麻风、哺乳地区的组织再生、麻醉剂、牙齿护理、刺激免疫反应、支气管炎、降低血压、镇静作用、防治胃溃疡、形成并维持血清葡萄糖、增强毛细管功能、粘膜炎血管舒张药(蜂胶软膏)、医用植皮保存剂等,关节内注射水提取物可治疗幼年变形性骨软骨炎。在兽医上,以20%的乙醇提取物每天早晚饲喂,可提高犊牛增重,减少腹泻的发生,还可用于治疗奶牛乳房炎、口服3%乙醇提取物治疗兔子球虫病,口服2-3%乙醇提取物治疗艾美球虫病。在意大利、索马里、几内亚比绍,蜂胶用于消毒和清洁种畜场。蜂胶作为抗氧化剂用于动物饲料和食品防腐剂中,可作为杀虫剂防治草莓害虫,还可作为植物抑制剂用于抑制植物、蔬菜和种子发芽。在日常生活中,希腊人用蜂胶和其它草药来制造一种叫夜香兰的香料。蜂胶被用于制作优质胶漆,如著名的斯特拉底瓦利斯小提琴就是用蜂胶漆制的。蒙古人和西伯利亚人用蜂胶来漆制雪橇底板。铁匠们用的防锈合剂、美容用的美容霜、染发剂、按摩油等都含有蜂胶。据联合国粮农组织(FAO)有关文献报道,国外已走向市场的蜂胶产品有蜂胶的各种提取液、促进组织再生的药膏,含蜂胶的洗发香波、肥皂、饴糖、面油、夜用面霜、面膜、牙膏、沐浴露等。蜂胶产品还有防晒液、蜂胶糖浆、蜂胶蜜、蜂胶片等。在化工产品中加入1-5%的蜂胶提取物,有利于增强保护皮肤、清除体表污垢、预防外在感染以及其它医疗保健功效。通常,含油类或脂肪类的化工产品用高浓度的乙醇提取液,含水分的化工产品用甘油或低浓度的乙醇提取液。口服液和鼻炎喷雾剂,采用2-10%的蜂胶丙烯乙二醇提取液。为增加芬芳味,加入过滤后的草药甘油或乙醇提取液。然后将这两种提取液根据口味按比例混合,在放入喷雾器之前还要将酒精提取液进行进一步稀释。蜂胶糖浆或蜂胶蜜,蜂胶糖浆是用蜂胶乙醇提取液加入葡萄糖或果糖浆中制成的糖浆,用于口服,生理作用比单种糖浆的效果好。蜂胶提取液和少量稀释蜂蜜混合,可制成蜂胶蜜,效果好。5、其他新型高效液相衍生物国外部分含蜂胶成分的专利产品如下:药品专利:局部消炎药Busciglio,1988;皮炎霜Iwasaki,1990;消炎和细胞生长抑制剂Nakanishi等,1988;组织再生促进剂(用于兽医),Dubaj等,1988;维生素C蜂胶安定片(内含91.5%的葡萄糖,5%的维生素C和3.5%的蜂胶酒精提取液)Dubosky等,1988;治疗仔猪肌肉发育不良药Mucsi等,1989。化工产品专利:除臭剂Vol’Fenzon等,1989;口腔洗漱液Cho等,1988。其它专利:包装食品的杀虫剂、杀菌剂Mizuno,1989。提取方法专利:WSD-水溶性衍生物Nikolov等,1987。另外,专利“具有改进水溶性的蜂胶提取物”由日本株式会社原生物化学研究所的阿贺创等于1997年在中国申请了发明专利。专利“含有一种酚化合物和蜂胶的治疗组合物,用作抗脂包膜病毒,特