丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备 朱一凡

丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备班级：生药1411姓名：朱一凡学号：2014044146指导老师：邓玉营一、简介聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂又称为共聚体的N,N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE）。与其他凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：①在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。③对pH和温度变化较稳定。④几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。⑤样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。⑥凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。⑦分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。二、电泳基本原理蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。三、实验器材及试剂1、试剂分离胶缓冲液（Tris-HCL缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL,Tris5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris6g,甘氨酸28.8g,用无离子水溶解后定容至1L。用时稀释10倍。30％Acr－Bis贮存液：30gAcr,0.8gBis,用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。TEM10%过硫酸铵（新鲜配制）；25%蔗糖溶液；0.05%溴酚蓝溶液；7%冰乙酸溶液。染色液：称取考马斯亮蓝R2502.5g，冰乙酸92ml，甲醇454ml，加去离子水454ml使其完全溶解，过滤ED；后置棕色瓶保存。脱色液：取甲醇50ml，冰乙酸75ml，加蒸馏水至1000ml。2、器材：垂直板型电泳槽、天平、直流稳压电源、50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅、染色槽、烧杯、吸量管、胶头滴管四、实验步骤1、安装垂直板电泳槽（1）将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠；（2）用手将两块玻璃板夹住放入电泳槽内，玻璃室凹面朝外，插入斜插板；（3）用蒸馏水试验封口处是否漏水。2、制备凝胶板（1）分离胶制备：取Acr-Bis储备液5.0mL,Tris-HCl缓冲液PH8.92.5mL,去离子水12.39mL,TEMED0.02mL置于小烧杯中混匀，再加入10%0.1mL过硫酸胺，用磁力搅拌器充分混匀2min。混合后的凝胶溶液，用细长头的吸管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用吸管在凝胶表面沿