植入前遗传学诊断

植入前遗传学诊断新进展

preimplantationgeneticdiagnosis(PGD)´s latestprogress

主讲：吴振楠2009041101组员：王芳，吴明瑶PGD的定义，应用及分类植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis/PGD)是辅助生殖技术与遗传学诊断技术相结合的一种植入前诊断技术，为遗传病高危夫妇提供尽可能大的选择范围，把对某些疾病发现和诊断的时机提前到胚胎发育的最早阶段，阻断一些单基因疾病及染色体异常疾病的发生是辅助生殖技术的一个重要方面。PGD的常规方法目前应用于PGD的常规方法有聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)和荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization．FISH)常用的PCR类型有巢式PCR、多重PCR、荧光PCR、荧光定量PCR等。PCR扩增后，用于后续基因诊断的方法主要有：①根据特异性目的条带的有无做出诊断，主要用于由基因缺失而引起的疾病的诊断。②多态性分析，即在致病基因附近寻找几个与其紧密连锁的DNA多态性位点。通过连锁分析进行诊断和携带者检测。③等位基因寡核苷酸特异探针(allele．specificoligonucleotide。ASO)斑点杂交及反向斑点杂交(reversedotblot，RDB)。④单链构象多态性(single．strandconformationpolymorphismanalysis。SSCP)及变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE)等FISH是用带有荧光标记的特异性探针与染色体结合后，在荧光显微镜下观察特定染色体的情况。常用于PGD的FISH探针有染色体记数探针(CEP)、染色体特异单一序列探针(CSI)等，针对不同的需要可以选用不同的探针。除了上述方法外，一些新方法、新技术不断出现并应用到临床PGD中。一、微阵列比较基因组杂交二、微测序技术三、多重置换扩增一、微阵列比较基因组杂交微阵列比较基因组杂交(comparativegenomiehybridization，CGH)CGH原理是提取待测与对照基因组DNA，标记不同荧光后以1：1的比例混合，与正常人中期染色体杂交。根据荧光的不同判定待检测基因组中对应序列拷贝数的改变。CGH可检测出一些不常见的异常，如5号与9号染色体三体，其发生率在l000次自然流产中不足1％。这也间接说明，一些未被识别的非整倍体异常同样对胚胎的发育具有致死性。CGH在PGD的应用有两种方式：单卵裂球CGH和第一极体CGH.因CGH需要3-4d才能出结果，考虑到体外受精治疗周期中的移植窗口期限制,拟施行CGH的卵裂球在活检后就需要对胚胎进行冻存，因此冻融后胚胎存活数目的下降是目前单卵裂球CGH的主要缺陷（缺点）。而第一极体在胞浆内配子注射后取出，即当日，这样便有足够时间等待CGH结果以挑选正常卵母细胞受精的胚胎。这种对卵母细胞间接的细胞遗传学分析，可检出在减数分裂I期分离过程异常造成的非整倍体，如三倍体或单倍体等，这也正是造成早期流产的主要原因。第一极体CGH虽然避免了胚胎冻融（优点），但对第一极体的检测不能检测卵母细胞减数分裂Ⅱ期及精源性异常。此外，第一极体CGH不能检测出嵌合性胚胎，但通过对第二极体的检测则能部分弥补这点缺陷。（缺点）二、微测序技术微测序技术，又称为单核苷酸引物延伸法(singlenucleotideprimerextension，SnuPE)，是一种有多种用途的新技术，已经广泛应用于法医学、人口遗传学等领域。其原理是设计一对针对突变位点的特异性引物，退火后直接结合于突变位点附近，同时加入与野生型及突变型模板互补的一种荧光双脱氧核苷酸，分别用不同的颜色标记4种双脱氧核苷酸，经过多轮的延伸与链终止过程，产生许多带有荧光标记的核苷酸片段，经毛细管电泳从而实现对模板序列的推导。微测序技术具有快速、敏感的特点，结合毛细管电泳技术可以一次实现对多个突变位点的检测而实现高通量分析。微测序技术开始主要用于检测单核苷酸多态性(·singlenucleotidepolymorphism，SNP)的突变位点。三、多重置换扩增多重置换扩增(multipledisplacementamplification，MDA)MDA是一种基于酶促反应而不依赖热循环的DNA体外等温扩增技术，可用于质粒、细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，BAC)及全基因组DNA的扩增。认为用MDA进行全基因组扩增(wholegenomeamplification，WGA)是当前效率最高的全基因组扩增方法。基因组中不同位置的各个位点都能通过MDA实现相似的扩增效率。Hellani等报道首例应用MDA诊断地中海贫血及囊眭纤维化的PGD。后来用于其他疾病的报道逐渐增多，如Marfan综合征等。MDA的缺陷有嵌合性DNA重排，包括序列倒位、序列重新拼结等。用于PGD时，MDA的主要缺点是等位基因脱手13(alleledropout，AD