10种真菌多糖对黄瓜花叶病毒的田间防效

10种真菌多糖对黄瓜花叶病毒的田间防效

黄瓜花叶病毒（cmv）是麻雀科的一种常见成员。CMV是一种单股正链RNA病毒,可侵染85科365属的1000多种单、双子叶植物,可经蚜虫和种子传播,是寄主范围最多、分布最广、最具经济危害性的植物病毒之一。CMV病发病流行速度极快,可致作物生长发育停滞,严重影响农作物的产量和质量,造成严重的经济损失。真菌多糖是各种真菌的子实体和菌丝体所产生的一类代谢产物,一般由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成。真菌多糖在医学上应用广泛,相应的报道也很多,研究表明,真菌多糖通过抑制病毒吸附、干扰病毒复制和提高机体免疫力等途径达到抑制人体病毒病的目的。随着真菌多糖在医学领域研究的不断深入,一些农业工作者从中得到启示,开始了真菌多糖在农业病害领域的应用和研究。王杰等研究表明,食用菌多糖能够封闭病毒的侵染位点,抑制病毒在寄主中的增殖,并增强寄主抗性。张超等研究表明,平菇多糖、金针菇多糖和香菇多糖均对烟草花叶病毒(TMV)和CMV具有显著的抑制效果。吴艳兵等发现,毛头鬼伞多糖对TMV具有较强的体外钝化和抑制侵染复制作用,可有效预防TMV病毒病。真菌多糖具有与葡萄糖激发子类似的抗病、抑病活性,可诱导植株产生和积累植保素、几丁质酶等抗病性物质,它不仅能够通过诱发植物抗性、激发植物免疫力达到防治植物病毒病的目的,而且具有良好的环境兼容性,在病害防治方面具有良好的应用前景。云芝(Coriolusversicolor)又称彩绒革盖菌,属于担子菌亚门。云芝多糖是云芝提取物中的主要活性成分,相对分子质量在1.3×106以上,是含有β(1→3)和β(1→6)糖苷键的葡聚糖。本研究测定了灰树花多糖、云芝多糖、灵芝多糖等10种真菌多糖对CMV的室内抑制作用及对烟草生长和烟苗中CMV含量的影响,并进一步研究了其田间防效,以期筛选出对CMV具有较好抑制活性的真菌多糖,为CMV的生物防治提供理论和实践依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试验中的茶多酚1.1.3试验病毒1.2聚乙二醇peg4000CMV粗提液的制备采用二次聚乙二醇沉淀法。将供试CMV病毒接种到NC89烟叶上,在22~30℃、自然光照条件下培养,5d后取67g感病叶片加134mL抽提缓冲液(0.5mol/L柠檬酸缓冲液,pH=6.5,含体积分数0.1%巯基乙醇),在组织捣碎机中捣碎,尼龙纱过滤后加氯仿至其体积分数为25%,振荡15min,置4℃冰箱内1h,然后5000r/min离心20min,取上清液加入聚乙二醇(PEG6000)至其体积分数为8%,并加NaCl至其质量浓度为30g/L,搅拌至PEG完全溶化后,置4℃冰箱内,4h后,8000r/min离心30min,取沉淀,用悬浮缓冲液(重蒸水)悬浮过夜,然后8000r/min离心10min,取上清液,沉淀用悬浮缓冲液再洗一遍,合并2次上清液,其总体积为原体积的1/10。取上述上清液,加入PEG6000至其体积分数为8%,并加NaCl至其质量浓度为30g/L沉淀,向沉淀中加入少量悬浮缓冲液过夜,然后8000r/min离心10min,所得上清液即为二次PEG6000沉淀的病毒粗提液。1.3测试方法1.3.1真菌多糖对基因型化的治疗作用真菌多糖对CMV侵染的室内钝化、预防和治疗作用的测定参考陈年春、逢丽丽等的方法。(1)真菌多糖对CMV的钝化作用。选取长势一致的苋色藜,将配制好的500,1000和2000mg/L的10种真菌多糖溶液分别与上述制备的病毒粗提液按1∶1的体积比混合,钝化30min后,用半叶法摩擦接种到苋色藜的左半叶,右半叶接种病毒粗提液作为对照,每个处理3株,每株处理3片叶。将处理后的苋色藜在温室中培养(22~30℃、自然光照),3~4d后统计枯斑数,计算钝化效果。(2)真菌多糖对CMV的预防作用。选取长势一致的苋色藜,将配制好的500,1000和2000mg/L的10种真菌多糖溶液分别涂抹于苋色藜叶片左半叶,右半叶涂抹清水作为对照,3d时再涂抹1次多糖,5d时全叶摩擦接种病毒粗提液,每个处理3株,每株处理3片叶。将处理后的苋色藜在温室中培养(22~30℃、自然光照),3~4d后统计枯斑数,计算预防效果。(3)真菌多糖对CMV的治疗作用。选取长势一致的苋色藜,全叶摩擦接种病毒粗提液,待表现枯斑症状后,将配制好的500,1000和2000mg/L的10种真菌多糖溶液涂抹于苋色藜的左半叶,右半叶涂抹清水作为对照,每个处理3株,每株处理3片叶。将处理后的苋色藜在温室中培养(22~30℃、自然光照),3~4d后统计枯斑数,计算治疗效果。1.3.2真菌多糖喷药处理选择长势一致的3~4叶期的NC89烟草幼苗移栽至花盆中,缓苗7d后,分别叶面喷施500,1000和2000mg/L的10种真菌多糖溶液,每隔7d喷施1次,共喷施3次,并设清水对照,每处理10盆,每盆1株烟苗。将处理后的烟苗在温室中培养(22~30℃、自然光照),1个月后观察记录烟苗的生长情况,测量烟苗的株高、茎围、地上部鲜质量、叶片数及最大叶面积。1.3.3喷微量蒸馏法用1000mg/L云芝多糖溶液诱导处理3~4叶期盆栽烟苗叶片,每株烟草喷上述云芝多糖溶液2~3mL,以喷等量蒸馏水的处理为对照。将处理后的烟苗放置于温度为22~30℃、自然光照的温室中培养24h,接种CMV病毒粗提液,从次日开始每天取3株烟苗,每株取3片叶,采用间接ELISA法检测诱导后烟苗叶片内的CMV含量(OD450值),并连续检测7d。1.3.4喷药次数及发病情况选择CMV常发烟田作为试验地,供试药剂为1000mg/L云芝多糖溶液,对照药剂为宁南霉素水剂和病毒A,设空白对照(清水);每处理面积为35m2,重复3次,各处理随机排列;用背负式手动喷雾器进行叶面喷雾,喷雾量以叶面滴水为标准,首次喷药5d后进行第2次喷药。第2次喷药后每7d调查1次发病情况,共调查3次,每处理随机5点取样,每点调查20株,共100株。以整株为单位调查发病情况,计算病情指数和防效:病情指数=∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高分级数)×100,防效=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%。2结果与分析2.1云芝多糖的预防从表1可以看出,10种真菌多糖对CMV均有一定的抑制效果,其中云芝多糖、灰树花多糖、灵芝多糖和蜜环菌多糖的抑制效果较好。真菌多糖对CMV的抑制效果与其质量浓度以及处理方式(钝化、预防、治疗)有关,其抑制效果随着多糖质量浓度的增大而提高,当多糖质量浓度为1000和2000mg/L时,云芝多糖的预防效果均较高,分别达79.83%和82.55%;其次为灰树花多糖、灵芝多糖和蜜环菌多糖,预防效果依次为67.80%,67.25%和66.65%;真菌多糖的预防效果最好,其次是钝化效果,治疗效果较差。总体来看,不同质量浓度云芝多糖处理对CMV的抑制效果有明显差异,其中1000mg/L云芝多糖处理对CMV抑制效果明显好于500mg/L处理,而当其质量浓度增加到2000mg/L时,抑制效果提高并不明显(图1)。2.2效果越明显由表2可以看出,不同质量浓度的真菌多糖对烟苗生长均具有一定的促进作用,并且质量浓度越高,促进效果越明显。1000mg/L的云芝多糖、灰树花多糖、灵芝多糖和蜜环菌多糖处理后的烟苗健壮,叶片浓绿光滑,明显优于对照,其中以云芝多糖的效果最为明显,株高比对照高87.37%,茎围比对照增加了48.28%,地上部鲜质量比对照高58.03%,最大叶面积比对照高222.27%。2.3病毒含量变化从图2可以看出,云芝多糖处理后,烟草叶片内的病毒含量总体保持在一个较低的水平,比对照中CMV含量低50.76%~89.96%,而对照病毒含量逐渐升高。2.4云芝多糖对cmv的防效从表3可以看出,施用云芝多糖后,在较长的一段时间内对CMV表现出较高的防效,在第7,14和21天,云芝多糖对CMV的防效分别达74.30%,68.07%和62.03%,防治效果显著优于对照药剂宁南霉素水剂和病毒A。3云芝多糖的质量浓度CMV引起的植物病毒病是一种在世界范围内传播的病害,其发生遍及各烟区,危害严重,造成重大的经济损失。目前,对CMV的防治以化学防治为主,然而随着烟草可持续发展以及化学农药“3R”问题的日益严重,生物农药越来越受到重视。作为天然生物物质,真菌多糖有着十分广泛的应用价值,不仅对植物病毒具有抑制活性,还可以诱发植物的抗病反应,因此可以作为植物生长调节剂和天然新型生物农药。本试验结果表明,不同质量浓度的真菌多糖对CMV均有一定的抑制作用,其抑制效果与多糖质量浓度及处理方式(钝化、预防、治疗)有关,抑制效果随着真菌多糖质量浓度的增加而提高;在不同处理方式中,真菌多糖对CMV的预防效果最好,其次为钝化效果,治疗效果较差。1000mg/L的云芝多糖对CMV具有良好的预防作用,室内枯斑抑制试验和田间药效试验防效分别高达79.83%和74.30%;云芝多糖对烟苗的生长还具有促进作用,1000mg/L云芝多糖处理烟苗株高、茎围、地上部鲜质量和最大叶面积比对照分别高87.37%,48.28%,58.03%和222.27%。云芝多糖的抗病毒机理可能是:(1)云芝多糖能够直接与CMV病毒在体外结合,降低了病毒对寄主的识别能力,导致其失活;(2)云芝多糖能够作用于寄主的病毒侵染接受点,使病毒失去和寄主细胞微伤口感受点结合的能力;(3)云芝多糖可在一定程度上诱导烟草对CMV的系统抗性,启动植物防御机制,达到抗病毒的目的。云芝多糖以其良好的抗CMV活性、促进作物生长、提高植物抗病性、以及对人畜、环境高度安全等优良性能,符合当前农药发展的方向,具有良好的开发应用潜力,但其具体作用机制还有待进一步研究。猴头菇多糖、云芝多糖、安络小皮伞多糖、灰树花多糖、灵芝多糖、猪苓菌多糖、黑木耳多糖、虫草多糖、