6种枣属植物流式细胞术流程及基因组大小的比较

6种枣属植物流式细胞术流程及基因组大小的比较

zizhiumile是老鼠科的第四种类型，其中z.jujabamile是中国独特的优势。目前,全国枣树栽培面积已达150万hm2,枣果年产量300万t以上,占全世界的99%以上,成为我国第一大干果树种。枣树以其抗旱耐瘠、早果速丰、营养丰富、用途广泛等优点,在经济和生产方面具十分重要的地位。酸枣(Z.acdiojujubaC.Y.ChengetM.J.Liu)是枣属中,除枣之外分布最广和利用价值最高的枣属植物之一。枣基因组大小(或称C-值)指的是单倍体细胞中全套染色体的DNA总量。C-值(C-value)单位一般为pg(picogram)或Mb(millionbasepair),而1pg相当于978Mb。到目前为止,包括被子植物、裸子植物、羊齿类、苔藓类以及藻类等的含有5150多种植物的DNAC值数据库(theplantDNAC-valuesdatabase)已经建立起来。基因组大小大约为63Mb的螺旋狸藻(GenliseamaragretaeHutch)是目前发现的基因组最小的被子植物,而百合科的四倍体贝母(FritillariaassyriacaBaker.)的127Gb的基因组为最大的基因组,两者相差约2000倍。真核生物的体细胞染色体数目和DNA含量在很大程度上是恒定不变的,因此C-值可以看作是一个特性参数,可用来评估生物体的生物特性。研究表明,细胞的大小、生物体的寿命、物种濒危程度以及细胞的代谢率等,都与基因组的大小有着一定的相关性,故基因组大小的研究对生物体的生理特性具有重要的意义。此外,对物种基因组大小的测定,可以为后期的全基因组测序中物种的选择和预算评估提供不可或缺的基础数据。早期的流式细胞仪(flowcytometry,FCM)主要应用在动物中,用流式细胞仪来测定植物细胞DNA含量出现于20世纪70年代。样品在高速液流中的DNA含量可通过流式细胞仪进行测定分析,单细胞悬浮液中的细胞核经DNA特异性染料染色后激发所发射的荧光信号被检测器捕捉,通过直方图进行量化分析,并与内参比较相对荧光强度进而计算出DNA含量。流式细胞术能在短时间内作用于大量群体细胞,已经被广泛地应用于非整倍性的鉴定、核基因组大小、倍性筛选、再生细胞凋亡、细胞循环的动力学等方面。它制样方法简便,检测结果稳定可靠。在进行流式细胞术分析中,细胞裂解液的作用尤其重要。它要确保细胞核在实验过程中的稳定性,防止DNA降解,以及促进DNA被特异性染料染色。目前已知有25种细胞裂解液,但是常用的仅仅有8种。由于它们的化学成分差异大,组织细胞组成的多样性,导致不同的裂解液对不同细胞的裂解效果差异很大。近年来,对这些枣属植物在亲缘关系和育种等方面有不少研究报道,然而针对它们的基因组大小的测定仍未见公开报道。本实验通过比较5种常用细胞裂解液对枣属植物细胞的裂解效果,找出枣属植物细胞最优裂解液,同时筛选优化其他条件,得到枣属植物最优的流式细胞术流程。以毛果杨(Populustrichocarpa,0.49pg/C,1pgDNA=0.978×109bp)作为内标,用流式细胞仪对每个枣属植物的6组样品进行重复上样,计算测定了‘冬枣’(Z.jujubacv.Dongzao)、‘鲁枣2号’(Z.jujubacv.Luzaonumber2)、‘金丝小枣’(Z.jujubacv.Jinsixiaozao)、‘孔府酥脆枣’(Z.jujubacv.Kongfusucuizao)、‘无核小枣’(Z.jujubacv.Wuhexiaozao)和酸枣(Z.acdiojujubaC.Y.ChengetM.J.Liu)的基因组大小。研究结果不仅可为枣属植物的种质鉴定提供依据,进而丰富物种的细胞遗传学数据,而且可为相关枣类的物种进化和分类研究以及基因组研究提供基础数据。1材料和方法1.1实验材料选取毛果杨实验材料取自组培苗,选取幼嫩叶片。‘冬枣’、‘鲁枣2号’、‘金丝小枣’、‘孔府酥脆枣’、‘无核小枣’及酸枣实验材料同样取自组培苗,选取幼嫩叶片。所有的材料都保存在北京林业大学林木育种国家工程实验室。1.2实验方法1.2.1叶片组织内标液制备选取幼嫩的酸枣叶片,称取5份,每份大约50mg,分别放入滴有750μL的5种细胞裂解液的培养皿中,用锋利的刀片快速将叶片切碎,300目的尼龙网过滤到离心管中,所得滤液在4℃离心机以1100g离心6min;用移液枪移去上清,将离心管倒置在纸上使剩余液体自然流干,收集沉积细胞。采用上述同样的操作方法,制备毛果杨细胞核悬浮液。选取大小相近的毛果杨和6种枣属植物的幼嫩叶片,进行混合制样,分别获得6种枣属植物与毛果杨的混合细胞核悬浮液,置于4℃环境中备用。1.2.2染色时间的选择向细胞核悬浮液中加入50μL染色缓冲液碘化丙啶(propidiumiodide,PI)(1mg/mL),置于4℃冰箱中,进行30min避光染色。1.2.3枣属植物细胞的荧光强度在流式细胞仪系统FACSAria(美国BD公司)上进行样品的分析。上样前,对流式细胞仪进行30min预热,利用488nm的蓝光激发,然后通过发射波检测PI的发射荧光,测定装置测定荧光强度,进而通过与之相连的计算机分析软件对荧光强度进行分析。PI通过均匀地插入双链DNA的碱基对中,对细胞核DNA进行特异性染色。在进行样品处理时加入RNA酶,能去除细胞中的RNA,PI即可对DNA进行特异性染色。由于PI的嵌入量与细胞核DNA的量成正比,因而荧光强度可以用来表示DNA的相对含量。通过比较待测样品和内标样品的荧光强度,可换算出待测样品和内标样品的DNA含量之间的比例关系。为比较5种常用细胞裂解液(表1)对枣属植物细胞的裂解效果,找出枣属植物细胞最适合裂解液,利用流式细胞仪测定以下各个参数:相对荧光强度(relativefluorescenceintensityofPI-stainednuclei,FL)、G0/G1期的变异系数(coefficientofvariation,CV)、核产出因素(nuclearyieldfactor,YF)和碎片因素(backgroundfactor,BF)。5种裂解液得到的直方图用WinMDI软件进行覆盖,每个裂解液处理重复6次。以二倍体毛果杨为对照,先对仪器进行校正,然后再作为内部标准,进行枣和酸枣的基因组大小的测定。每个枣属植物样品进行6次重复检测,每次样品至少被获取15000个细胞,所有测试样品细胞核DNA含量均是以毛果杨为标准的相对值。根据公式P=F1/FHH(P为待测样品的DNA含量;F1为待测样品的荧光强度;FH为内标的细胞样品的荧光强度;H为内标细胞DNA含量)可计算出待测样品的DNA含量。2结果与分析2.1流式分析结果以酸枣为实验材料,利用流式细胞仪研究比较了5种裂解液对枣属植物细胞的裂解效果(表2)。除了Tris-MgCl2裂解液外,其他4种裂解液对枣属植物细胞都有一定裂解作用。对于FL值,2个裂解液组有统计上的显著差异。用Galbraith和GPB进行裂解样品得出的FL值比用WPB和LB01得出的低(图1、表2)。最高的FL值出现在WPB裂解的样品中,最低的FL值出现在Galbraith中,说明从FL值这个参数层面来看,WPB细胞裂解液更适合枣属植物细胞的裂解。在用5种细胞裂解液对酸枣进行流式分析中,除了Tris-MgCl2,G0/G1期变异系数CV都小于5%,但是不同裂解液所得CV值差异显著,其中WPB裂解液的CV值最小,为1.93%。评价样品质量的BF值在各裂解液之间无统计学上的差异,最小值出现在WPB裂解液所制备的样品中。对比YF值,同样有2个组有统计学上的差异,其中LB01得到的YF值较大。裂解液的选择标准为有最高的FL和YF值,以及最低的BF和CV值。通过表2发现,WPB在4种裂解液中具有最高的FL值,并且CV值和BF值也是最低的。由图1可以看出,WPB裂解液制备的样品流式细胞图出峰清晰、稳定、杂峰少。LB01的YF值虽然与WPB差异不大,但是其BF值较高,说明制备的样品碎片杂质较多,这种现象同样存在于Galbraith和GPB中,这也在图1中得到了体现。WPB裂解液相比于其他4种裂解液,对枣属植物细胞的裂解效果最好。用WPB裂解液来进行毛果杨的流式分析,CV值为1.93%,峰图清晰、杂峰很少,并且可以清楚地观察到G2期,这说明WPB裂解液同样适合于毛果杨细胞的裂解。综上所述,Tris-MgCl2最不适合作枣属植物流式分析的裂解液,以毛果杨为内标,进行6种枣属植物基因组大小的测定,选用WPB细胞裂解液是合适的、可靠的。2.2流式细胞术检测结果以二倍体毛果杨为实验内标,选用WPB裂解液,利用流式细胞仪对6种枣属植物的基因组大小进行测定。毛果杨已于2004年完成全基因组测序,其基因组大小为480Mb。在预实验中,毛果杨流式分析中出峰快且稳定,杂峰少,被选择作为内标以测定枣属植物基因组大小。本研究优化筛选后的流式分析FL2-W参数,使待测样品和内标的粒子清晰集中,且混合样品的粒子团能同时被检测到,毛果杨、‘冬枣’、‘鲁枣2号’及酸枣样品的散点图如图2所示。在流式细胞仪分析中,细胞各个时期的分布状态均可以观察到,分别为G0/G1期,S期及G2/M期。流式细胞术分析的精确度通常用G0/G1峰的变异系数来反映,CV值应小于5%,实验结果才真实、可信。以毛果杨作为标准参照,用流式细胞仪测定6种重要枣属植物的基因组大小,所得的检测图像如图3所示。毛果杨基因组的测定峰与6种枣属植物基因组测定峰无重叠,保证了用已知基因组大小的毛果杨作内标测定枣和酸枣基因组大小的合理性和准确性。6种枣属植物流式细胞仪测定结果如图3所示,通过比较G0/G1期的峰值,可得出它们的基因组大小都略小于毛果杨,分别为:‘冬枣’的基因组大小是毛果杨的0.82倍,‘鲁枣2号’是毛果杨的0.89倍,‘金丝小枣’是毛果杨的0.88倍,‘孔府酥脆枣’是毛果杨的0.90倍,‘无核小枣’是毛果杨的0.86倍,酸枣是毛果杨的0.92倍。根据毛果杨基因组大小为480Mb,可估算出‘冬枣’的基因组大小为(393.60±4.72)Mb,即C-值为(0.40±0.01)pg;‘鲁枣2号’的基因组大小为(428.00±3.61)Mb,即C-值为(0.44±0.00)pg;‘金丝小枣’的基因组大小为(424.00±5.81)Mb,即C-值为(0.44±0.01)pg;‘孔府酥脆枣’的基因组大小为(429.60±5.03)Mb,即C-值为(0.44±0.01)pg;‘无核小枣’的基因组大小为(413.60±7.07)Mb,即C-值为(0.42±0.01)pg;酸枣的基因组大小为(441.60±4.29)Mb,即C-值为(0.45±0.01)pg(表3)。在流式细胞仪分析中,6种枣属植物的流式直方图上出现了双峰(图3B、C、E、F),且双峰出峰位置比例保持较为稳定。通过计算发现,2个峰的道数值(出峰位置)呈2倍关系。由此可知,第1个峰代表的是G0/G1期的DNA含量,第2个峰代表的是G2/M期的DNA含量。3细胞裂解液的制备及内标测定目前测定基因组大小的方法较多,显微分光光度计法(microspectrometry)、孚尔根光密度测量法(feulgendensitometry)和流式细胞术(flowcytometry)是用的最多的3种方法。其中流式细胞术具有制备样品流程较短、操作方便、测定快速等优点,因此被越来越多的实验人员应用于基因组大小检测、DNA和RNA含量比测定等领域;然而,由于所采用的裂解液、材料类型、测定方法、处理环境等因素不同,同一物种的基因组大小测定结果可能会有所不同。流式细胞术分析中,细胞裂解液的选择至关重要,合适的裂解液能使样品的分析更加准确、可靠。常用的裂解液都是借助于有机缓冲剂,如3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、三羟甲基氨酸甲烷(Tris)等,来稳定悬浮液的pH,通过添加非离子清洁剂,如TritonX-100、吐温-20等来促进细胞核的释放,防止核凝聚。此外,有些裂解液中还加入螯合剂、无机盐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等物质以期达到好的细胞裂解效果。Loureiro等于2006年在7种植物上比较了4种细胞裂解液的效果,发现Tris-MgCl2是效果最差的裂解液,其次是Galbraith,LB01和Otto’s的裂解效果最好。后来他又在37种植物上比较了2种新型的细胞裂解液WPB和GPB的裂解效果,发现在木本植物细胞中,GPB的裂解效果不如WPB。由于植物组织细胞的多样性,不可能存在一种裂解液能对所有植物都有好的裂解效果。本研究选取了5种细胞裂解液(表1),定义4个参数(FL、BF、CV、YF)来评价各个裂解液对枣属植物细胞的裂解效果(表2)。对枣属植物而言,WPB的裂解效果最好,这可能是因为WPB含高体积分数(1.0%)非离子性去垢剂TritonX-100,能使叶绿体细胞溶解,减少了杂质微粒的数目,从而降低了杂质信号的干扰。此外,枣属植物细胞中含有大量的糖类、酚类等黏性物质,WPB中添加了0.1%PVP,能有效地消除黏性物质的存在,进而取得了理想的效果。Bennett等强调内标的选择对流式细胞仪测定结果有着重要的影响。早期的流式细胞仪分析中,通常采用鸡红细胞、人淋巴细胞、鳖红细胞等作为内参;但有研究表明,植物和动物的细胞核水解速率不同,当两者混合制样时可