聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓总黄酮工艺研究

聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓总黄酮工艺研究

土耳其语是百合科广叶谷的干燥根系，具有除湿、解毒、关节和其他功能。土茯苓中含有多种二氢黄酮类衍生物,如落新妇苷(astilbin)、异落新妇苷(isoastilbin)等。近年来药理、临床实验证明土茯苓具有抗癌、抗动脉硬化等作用,主要有效成分落新妇苷具有较强的抗炎、镇痛、利尿作用。笔者未见国内用聚酰胺吸附处理、纯化土茯苓总黄酮的报道。本研究采用聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓总黄酮,通过考察不同条件下聚酰胺颗粒对土茯苓总黄酮的静态和动态吸附与解吸特性,优选出最佳的纯化工艺。1药品、化学品和聚酰胺颗粒Agilent1100高效液相色谱仪,KromasilC-18柱(4.6mm×250mm,5μm);普析通用TU-1901紫外可见分光光度计;德国BP211DSartorius电子天平(十万分之一);落新妇苷对照品:广州医药工业研究所曾祥腾老师提供;黄杞苷对照品:广东食品药品职业学院颜仁梁老师提供;芦丁对照品:购自中国药品生物制品检定所,批号:100080-200306。聚酰胺颗粒(14～30目):浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂生产;乙腈(色谱纯,SIGMA公司)。水为重蒸水,其它实验所用试剂均为分析纯。土茯苓药材购于佛山市南海鹏扬药业有限公司,经广东食品药品职业学院中药与生物系颜仁梁老师鉴定为百合科光叶菝葜(SmilaxglabraRoxb.)的干燥根茎。2方法2.1重量测定2.1.1标准品溶液的制备采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法,以芦丁为对照品,试样中加入铝离子试剂,同时控制适宜的pH值,使黄酮类物质与铝离子形成络合物,在可见光区获得稳定的特征吸收峰,进行比色法测定。标准曲线的绘制:取经105℃干燥至恒重的芦丁对照品适量,精密称重为5.99mg,置25mL量瓶,加70%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得浓度为0.2396mg/mL的标准溶液。精密吸取该标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL分别置25mL量瓶中,各加70%乙醇至6.0mL,加5%NaNO2溶液1.0mL,摇匀,放置6min,加入10%Al(NO3)3溶液1.0mL,摇匀,放置6min,加NaOH试液10.0mL,加70%乙醇至刻度,混匀,放置15min,以1号量瓶溶液为空白,于505nm处测定吸光度值,以芦丁量(mg)为横坐标,以吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,回归方程为Y=0.4572X-0.0173,r=0.9996(n=6),芦丁在0.2396～1.4376mg范围内具有良好的线性关系。2.1.2线性关系的考察色谱条件:KromasilC-18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:磷酸水溶液(pH=3)-乙腈(80∶20);柱温:30℃;流速:1.0mL/min;检测波长:290nm,理论塔板数以落新妇苷峰计不低于8000。标准曲线的绘制:对照品溶液:称取落新妇苷、黄杞苷对照品适量,精密称定,加60%乙醇溶解,分别制成每1mL含233μg的落新妇苷对照品储备溶液和每1mL含50.24μg的黄杞苷对照品储备溶液。精密吸取落新妇苷对照品储备溶液1、2、3、4、5、6、7、8mL及黄杞苷对照品储备溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2mL,置10mL量瓶中,加60%乙醇稀释至刻度,制成系列混合对照品溶液,精密吸取上述混合对照品溶液各10μL,注入液相色谱仪,分别记录峰面积,以峰面积为纵坐标,对照品进样量(μg)为横坐标,进行线性回归,回归方程为:落新妇苷Y=2343.7X-9.8517,r2=0.9999(n=8);黄杞苷Y=2014X+9.975,r2=0.9999(n=7,1号溶液未检出黄杞苷峰),结果表明落新妇苷在0.233～1.864μg、黄杞苷在0.0402～0.1608μg范围内呈良好的线性关系。精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,以外标法计算,即得样品溶液中落新妇苷、黄杞苷的含量。2.2无醇味剂和醋酸参考有关文献,取聚酰胺颗粒用95%乙醇浸泡48h,水洗至无醇味,用1%NaOH浸泡24h,水洗至中性,10%醋酸浸泡24h,水洗至中性,减压干燥备用。2.3总黄酮浓度的测定取土茯苓饮片150g,粉碎,60%乙醇回流提取3次,滤过,合并滤液,回收乙醇至无醇味,加热水稀释,离心,取上清液定容至1000mL(6.7mL/g生药),即得,总黄酮浓度为10.52mg/mL。2.4总黄酮浓度的测定取经预处理的聚酰胺颗粒适量,精密称重,置具塞三角瓶中,加入土茯苓总黄酮浓缩液,充分震荡,过滤,测定滤液中总黄酮浓度。计算并绘制聚酰胺颗粒静态吸附动力学曲线。分别取已吸附饱和的聚酰胺颗粒,置具塞三角瓶中,加入解吸液,充分震荡,过滤,测定解吸液中总黄酮浓度。按下式计算聚酰胺颗粒的吸附容量α与解吸率β。α=C0×V0−C1×V1mα=C0×V0-C1×V1m;β(%)=C2×V2C0×V0−C1×V1×100%β(%)=C2×V2C0×V0-C1×V1×100%其中,C0为土茯苓总黄酮浓缩液的初始浓度(mg/mL),C1、C2分别为吸附后、解吸后的滤液中平衡浓度(mg/mL);m为聚酰胺颗粒重量(g),V0为加入的土茯苓总黄酮浓缩液体积(mL),V1为吸附液体积(mL),V2为解吸液体积(mL)。2.5茯苓提取液总黄酮的测定称取经预处理的聚酰胺颗粒,湿法注入玻璃柱。室温下取适量土茯苓提取液通过聚酰胺分离柱,水洗,95%乙醇洗脱,检测洗脱液中的总黄酮量。考察水洗量、最大上样量、洗脱剂浓度、洗脱剂用量等对土茯苓总黄酮纯化的影响,进行动态吸附与解吸附实验。3结果与分析3.1聚吡咯的静态吸附和分解3.1.1静态吸附动力学曲线取聚酰胺颗粒适量(约1g)7份,精密称重,置具塞三角瓶,精密移入20mL土茯苓提取液,在30℃恒温水浴中时时震荡,于规定时间取样测定上清液中总黄酮含量,计算聚酰胺颗粒对土茯苓总黄酮单位重量的吸附量,并对时间作图,绘制静态吸附动力学曲线(图1),聚酰胺颗粒对土茯苓总黄酮吸附2h基本达到平衡。3.1.2聚酰胺颗粒的吸附量和解吸率的测定取聚酰胺颗粒适量(约1g)3份,精密称重,置具塞三角瓶,精密移入20mL土茯苓提取液,在30℃恒温水浴中时时振荡3h,过滤,测定滤液中总黄酮含量,计算聚酰胺颗粒对土茯苓总黄酮单位重量的吸附量;取已吸附饱和的聚酰胺颗粒置具塞三角瓶,加入95%乙醇,超声提取2次,每次25mL乙醇超声1h,过滤,合并滤液,测定滤液中总黄酮含量,计算95%乙醇对聚酰胺颗粒吸附总黄酮的解吸率(表1)。95%乙醇对聚酰胺颗粒(14～30目)吸附总黄酮的平均解吸率达到90.43%。3.2聚吡咯的动态吸附和分解3.2.1水洗脱干膏量测定取土茯苓提取液10mL共5份,上聚酰胺分离柱(2g),静置0.5h,分别以10、15、20、25、30倍量(BV)的水洗脱,收集水洗液,同时检测是否有黄酮流出,以水分分析仪测定水洗液中的干膏量,结果见图2。结果显示,当水洗量超过20BV时,水洗液中干膏量无明显差别,且黄酮鉴别均为阴性,故以20BV的水洗脱为宜。3.2.2洗脱溶剂总黄酮的测定分别取土茯苓提取液15、20、25、30、35mL,上聚酰胺分离柱(2g),静置0.5h,依次用20BV水、95%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,浓缩,定容,按“2.1”项下方法测定洗脱液中总黄酮的量,结果见图3。结果显示,当上样量超过25mL时,乙醇洗脱液中土茯苓总黄酮量无显著差异,说明25mL该浓度水沉液上样量为饱和上样量(按土茯苓总黄酮计为128.125mg/g)。3.2.3洗脱溶剂的筛选取土茯苓提取液25mL共4份,上聚酰胺颗粒柱(2g),静置0.5h,用20BV水洗脱,分别继用30%、50%、70%、95%乙醇洗脱至无颜色,收集各浓度洗脱液,按“2.1”项下方法测定洗脱液中总黄酮的量,结果见图4。结果显示,聚酰胺颗粒分离柱用95%乙醇洗脱的洗脱液中总黄酮的量高于其他浓度乙醇洗脱的总黄酮量,故洗脱溶剂的浓度确定为95%乙醇。3.2.4洗脱总黄酮的测定取土茯苓提取液25mL5份,上聚酰胺颗粒柱(2g)用20BV水洗脱,静置0.5h,分别以上样量的10、15、20、25、30倍95%的乙醇洗脱,收集各乙醇洗脱液,按“2.1”项下方法测定洗脱液中总黄酮的量,结果见图5。结果显示,20、25、30倍上样量洗脱时,乙醇洗脱液中总黄酮的量无明显差异,故确定以20BV的95%乙醇为最佳洗脱用量。3.2.5洗脱溶剂总黄酮的测定取土茯苓提取液25mL5份,上聚酰胺颗粒柱(2g),静置0.5h,用20BV水洗脱,以20BV95%的乙醇洗脱,流速分别为0.5、1、1.5、2、2.5BV/h,收集各乙醇洗脱液,按“2.1”项下方法测定洗脱液中总黄酮的量,结果见图6。结果显示,洗脱剂流速越快,乙醇洗脱液中总黄酮洗脱量越低,但洗脱剂流速为0.5BV/h时,实验耗时太长,综合考虑洗脱效率与总黄酮含量,确定洗脱剂流速为1BV/h。3.2.6聚酰胺富集物含量测定结果取经预处理的聚酰胺颗粒100g,湿法装柱,按照优化的工艺对土茯苓提取液总黄酮进行富集纯化,乙醇洗脱液减压回收乙醇,残渣65℃真空干燥至恒重,得棕黄色粉末。取上述粉末约0.1g,定容至100mL,测定总黄酮及落新妇苷、黄杞苷的含量,计算总黄酮及落新妇苷、黄杞苷得率。结果:聚酰胺富集物中总黄酮含量为71.84%,转移率为66.42%;落新妇苷含量为14.32%,转移率为75.50%;黄杞苷含量为1.08%,转移率为81.88%。4聚酰胺吸附法静态、动态实验表明,聚酰胺颗粒对土茯苓总黄酮有良好的选择吸附性,总黄酮含量可达71.84%,落新妇苷含量可达14.32%。黄少伟等研究了大孔树脂分离纯化土茯苓总黄酮,同大孔树脂相比,聚酰胺不仅是一种价廉易得的化工材料,且具有较好的酸碱耐受性