鸡球虫病的发生与防治

鸡球虫病的发生与防治

鸡球病是由头复器门、唑酮昆虫、真甲虫、艾美霉素和艾美霉素引起的一种全球分布的原生动物。发病率为50%70%，死亡率为20%30%，严重时为80%。每年全世界因球虫病造成的经济损失超过30亿美元。鸡只感染球虫后能诱导机体产生特异、持久的免疫保护力。一般只有足够的卵囊才能刺激机体产生坚强的免疫力,但是有的虫种也有例外,如巨型艾美耳球虫就具有很强的免疫原性,仅需较小剂量的卵囊就能刺激机体产生坚强的免疫力。尽管巨型艾美耳球虫配子体抗原具有很好的免疫原性,但能诱导机体产生抗人工感染活卵囊的免疫保护力,人们普遍认为球虫在生活史的早期阶段(内生殖阶段)比后期的有性生殖阶段具有更好的免疫原性。T淋巴细胞因裂殖子的入侵而被刺激活化后,可分泌产生IFN-γ等细胞因子和趋化因子,而IFN-γ能抑制球虫在宿主细胞内的繁殖,这表明宿主能产生抑制寄生虫在体内呈指数繁殖的保护性免疫应答。由于宿主与寄生虫间相互作用(免疫生物学)的复杂性,包括多种细胞和可溶性蛋白因子的参与,因此进一步阐明球虫感染刺激机体产生免疫应答的机理,是制定球虫病免疫预防策略的基础和重要环节。球虫具有复杂的生活史,既有细胞内阶段,又有细胞外阶段,且具有宿主和寄生部位的特异性,即种间存在病原性差异,因而自然感染的宿主对球虫的免疫性也具有种特异性,即对一个虫种具有免疫力的机体对另一个虫种缺乏免疫力。因此,宿主对球虫的免疫反应也变得十分复杂。当球虫入侵到宿主肠道时,刺激机体产生包括体液免疫和细胞免疫在内的特异性免疫和非特异性免疫反应。非特异性因素包括皮肤黏膜屏障、吞噬细胞、粒性白细胞、趋化因子和补体成分等。由于球虫入侵特异的鸡肠上皮细胞,并在其中增殖,故肠道相关淋巴组织(Gut-associatedlymphoidtissue,GALT)在抗球虫感染过程中发挥重要作用,主要有3个方面的功能:加工、递呈抗原,产生肠道内抗体,激活细胞免疫。球虫初次感染宿主后,激活局部DC细胞和巨噬细胞,分泌产生多种趋化因子和细胞因子,使虫体在体内的增殖受到抑制。最近的研究表明,球虫感染期间,感染局部有多种细胞因子产生,能增强机体的抗球虫免疫能力。1抗体的特异性球虫感染后,在鸡血清、胆汁和肠道均能检测到特异性循环抗体或分泌型抗体。然而,肠道和血清抗体滴度与保护水平不完全相关。通过激素和化学方法去除法氏囊后的鸡只,对球虫的再感染仍具有抵抗力,这为抗体在抗球虫感染中的作用地位提供了最有力的证据。禽类的3种抗体分别是IgM、A和Y,编码IgY重链区的cDNA序列与哺乳动物IgE的重链区序列也很相似。有关血清特异性抗体在抗球虫感染中的作用已有广泛研究,母源IgY主要存在于鸡蛋的卵黄囊中,在鸡胚的发育后期进入鸡胚。因此,人们普遍认为IgY与母源被动免疫有关。当给母鸡免疫接种高剂量巨型艾美耳球虫配子母细胞表面抗原后,能使孵化小鸡在攻虫后卵囊的排出减少,说明该小鸡体内产生了抗配子母细胞的抗体。至于母源抗体在田间抗球虫感染中有何作用,还需进一步证实。2球虫感染的鸡肠道组织t细胞的活性变化研究表明,摘除法氏囊不影响鸡抗球虫感染免疫的产生。但是,缺失T淋巴细胞的功能,就会影响机体抗球虫保护性免疫的形成,这提示细胞免疫在抗球虫感染中起重要作用。从巨型艾美耳球虫免疫鸡分离的外周血淋巴细胞和脾细胞,可对同源活卵囊攻击感染产生抵抗力。体外研究也表明,从柔嫩艾美耳球虫免疫鸡分离的脾细胞能抑制或阻止柔嫩艾美耳球虫在肾细胞内的繁殖。已通过球虫免疫鸡T淋巴细胞对特异抗原的增殖试验而研究证实存在球虫特异的T淋巴细胞。肠道上皮内淋巴细胞是肠相关淋巴组织的重要代表。雏鸡初次和2次感染堆型艾美耳球虫后,十二指肠上皮内αδ-T淋巴细胞所占比例升高,同时IL-2mRNA的转录水平显著升高。在鸡球虫感染中,通过用抗CD8+的单克隆抗体选择性淘汰CD8+细胞可导致病情加重,用柔嫩或堆型艾美耳球虫攻虫感染后卵囊的排出量增加。用堆型艾美耳球虫感染健康鸡可使肠上皮内T淋巴细胞CD8+分子的表达水平明显升高。应用双色免疫荧光染色法研究发现,球虫免疫鸡十二指肠上皮内CD8+细胞主要表达αβ-TCR,有研究表明堆型艾美耳球虫感染后十二指肠上皮内淋巴细胞中CD4+、CD8+和αβ-TCR的比例升高,柔嫩艾美耳球虫感染后,盲肠上皮内CD4+、CD8+细胞的比例也升高。被柔嫩艾美耳球虫感染的鸡,仅感染后2d盲肠内CD4+细胞的数量就显著升高,CD4+和CD8+T细胞浸润到基底膜。在免疫鸡的CD3+、CD8+T细胞内及其αβ-TCR周围能检测到大量子孢子。由此可知,T细胞在抗球虫免疫中发挥重要作用。而且,柔嫩艾美耳球虫初次感染鸡后8dIFN-γ和NO(一氧化氮)的表达量也明显升高。体外研究发现,T细胞促有丝分裂原(Mitogen)和柔嫩艾美耳球虫子孢子可刺激外周血淋巴细胞增值。NK细胞在抗球虫感染中的作用已经得到证实,鸡肠道上皮内淋巴细胞中有能刺激NK细胞活化的细胞亚群,这与用不同鸡肿瘤细胞经铬-51释放试验(51Cr-releaseassays)的研究结果一致。在空肠和回肠,NK细胞的活性比在十二指肠和盲肠高。柔嫩艾美耳球虫初次接种感染鸡后,在感染早期阶段脾淋巴细胞和肠上皮内淋巴细胞活性均降低到亚正常水平,但大约感染后1周又回到正常或较高于正常水平。最近发现,从肠道分离鉴定的一个基因在球虫感染后表达量升高,而这个基因与猪NK-溶素(NK-lysin)基因相似,其表达的动力学变化与卵囊排出量一致,这提示在球虫感染期间,NK-溶素是NK细胞活性重要的调节剂。Vervelde等研究还发现,柔嫩艾美耳球虫免疫鸡,有更多的粒性白细胞存在于盲肠黏膜固有层,且更容易浸润到盲肠。大多数浸润粒细胞是巨噬细胞和T淋巴细胞。Dimier等发现,巨噬细胞预先用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激相关的脾淋巴细胞上清培养处理后,对柔嫩艾美耳球虫子孢子生长有抑制效应。3鸡感染艾美耳球虫的免疫机制黏膜免疫是指机体与外界相通的腔道黏膜表面的免疫,该系统主要由胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道及某些外分泌腺(如唾液腺、泪腺及乳腺等)黏膜相关的淋巴组织组成,该系统含有IgA型浆细胞及产生slgA抗体而引起局部免疫的保护作用。也有研究表明,肠相关淋巴组织、气管相关淋巴组织、肠系膜淋巴结、淋巴集结和扁桃体等相互作用,共同形成一个免疫网络,即存在共同黏膜免疫系统。肠道是机体最大的免疫器官,能产生70%~80%的免疫球蛋白,其中IgA和IgM是肠道优势的免疫球蛋白。IgA对球虫的免疫保护作用已被广泛地研究。鸡感染艾美耳球虫,会产生循环型和分泌型的IgG、IgY、IgA抗体。循环型IgY和胆汁型IgA抗球虫抗体在感染1周后出现,8~14d为高峰期,可持续2个月。有研究报道抗柔嫩艾美耳球虫的血清型IgM在感染后17d出现高峰,胆汁型slgA在柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫感染1周前出现,但不能诱导记忆性的slgM反应,但其感染部位特异性的IgA、IgM水平显著增高。slgA可能附着到球虫表面,通过堵塞、位阻、构型改变及减少运动等途径阻止其黏附到上皮细胞,也可能直接同入侵的子孢子、裂殖子作用,阻止其在细胞内发育。胆汁型slgA高浓度伴随感染鸡低数量子孢子,这说明该抗体对子孢子有抑制作用。易亚斯还观察到鸡感染柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫后肠道中特异性slgA的水平最高。4局部感染后il-2的表达淋巴细胞及其分泌产物(细胞因子和趋化因子等)介导的抗原特异免疫反应在抗球虫感染中发挥重要作用,但是由于研究方法和技术的滞后,许多鸡细胞因子的特点和功能并不清楚。目前,研究报道最多的主要有IFN-γ、转录生长因子(TGF)、白细胞介素(IL-2、6、8、15)。近年来,一系列新的细胞因子的功能得到研究和描述,其中有IL-17、18、16、12、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和主要作用于Th2型淋巴细胞的细胞因子,如IL-3、4、5、10、13。4.1IFN-γ干扰素(IFN)分为Ⅰ型(IFN-α、β、ω和τ)和Ⅱ型(IFN-γ),主要由抗原和有丝分裂原刺激的CD4+和CD8+T细胞分泌产生,其次是NK细胞。IFN-γ在抗鸡球虫保护性免疫中起重要作用。Yun等证明,在抗球虫感染免疫中,以肠内IFN-γ的分泌来介导宿主产生保护性免疫反应。用ConA刺激巨型艾美耳球虫或变位艾美耳球虫感染鸡的脾T细胞,可产生IFN-γ。用抗IFN-γ的单抗清除IFN-γ后,球虫感染鸡的卵囊排出量增加。地塞米松处理鸡后对变位艾美耳球虫易感性增加,IFN-γ的产生减少。堆型艾美耳球虫感染后,在盲肠扁桃体和脾脏均能检测到IFN-γ的表达。鸡初次和再次感染柔嫩艾美耳球虫后,在脾脏、盲肠扁桃体和肠上皮内淋巴细胞均能检测到IFN-γ转录本。IFN-γ对柔嫩艾美耳球虫子孢子的直接作用已在体外多种系统中得到研究。有研究发现,用含有重组IFN-γ的培养基孵育子孢子后,子孢子对宿主细胞侵入及其在宿主体内的发育无任何影响。用重组IFN-γ处理鸡肠上皮细胞,虽然不能影响子孢子入侵宿主细胞,但能抑制子孢子在细胞内的进一步繁殖,且在体外预先用重组IFN-γ处理培养的肠上皮细胞,其对子孢子的发育影响比在感染后进行处理的更明显,如在感染24h后进行处理,则对球虫的发育无任何影响。这提示IFN-γ可能通过介导细胞免疫来抑制子孢子的侵入和移行,从而诱导机体产生保护性免疫反应,而IFN-γ本身对子孢子并无毒害作用。IFN-γ还可激活巨噬细胞,增强MHCⅠ、MHCⅡ类抗原的表达,提高K细胞、NK细胞的毒性作用,促进IL-1、IL-6和TNF-α等的分泌。4.2IL-2IL-2主要由抗原或有丝分裂原激活的CD4+Thl细胞分泌,是介导细胞免疫的主要细胞因子之一。其主要作用是促进CD4+、CD8+T细胞分化、增殖,维持T细胞生长,增强NK细胞和B细胞功能,活化巨噬细胞;诱导CTL、NK等杀伤细胞的分化和效应功能的激活,诱导产生TNF及激活IL-2自身。已经证实,IL-2在抗柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫感染中发挥作用。Miyamoto等研究发现,柔嫩艾美耳球虫首次感染鸡后7d血清中IL-2水平显著升高,用有丝分裂原或柔嫩艾美耳球虫子孢子刺激的脾脏淋巴细胞培养物上清中IL-2水平也明显高于对照组,且IL-2可引起机体对再感染的记忆应答。Choi等的研究表明,堆型艾美耳球虫感染鸡后,其脾脏和肠内IL-2的表达均明显增强。上述结果提示,球虫感染鸡可能是通过上调IL-2分泌水平介导细胞免疫反应。4.3TNF(肿瘤坏死因子)TNF主要由巨噬细胞分泌产生,分离柔嫩艾美耳球虫或巨型艾美耳球虫感染鸡肝脏的巨噬细胞,与脂多糖一起培养,分泌产生的TNF-α水平明显高于未感染鸡巨噬细胞分泌的TNF-α水平。有研究表明,脂多糖或柔嫩艾美耳球虫子孢子、裂殖子可刺激鸡巨噬细胞分泌TNF,其产量与鸡初次感染柔嫩艾美耳球虫的时间和剂量有依赖关系,但与二次感染无依赖关系,而且适量TNF有利于机体清除虫体。巨型或柔嫩艾美耳球虫感染后很快就能检测到巨噬细胞分泌的TNF样活性因子,而且在鸡发病时达到第1次高峰,达第2次高峰时保护性免疫形成,感染后3~6d有大量TNF产生,这与球虫诱导机体发生局部和全身病理变化相关。TNF的作用机制主要是增强吞噬细胞的吞噬功能,活化的巨噬细胞通过产生活性氧自由基,如O2、H2O2、OH-等,经脂质过氧化反应杀伤球虫。此外,TNF可刺激内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、枯否氏细胞和肝细胞产生NO等,从而抑制线粒体的功能,使球虫能量生成减少,最终导致虫体发育障碍甚至死亡。因此,TNF可能在抗球虫感染中发挥重要作用。4.4TGF-β(转化生长因子)TGF-β是一种多效的抗炎症细胞因子,机体损伤后能促进上皮黏膜修复。分泌TGF-β的淋巴细胞能下调机体的免疫水平和炎性反应,尤其是肠黏膜的炎性反应。通过cDNA探针和不同亚型TGF-β的特异性抗体能检测到机体内TGF-β2、3和4的表达。堆型艾美耳球虫感染后,肠上皮内淋巴细胞中TGF-β4的表达水平升高5~8倍,脾细胞中TGF-β4的表达水平则升高2.5倍,而这些细胞中TGF-β2和TGF-β3的表达仍然没有变化。尽管到目前为止,禽球虫病中有关TGF-β的功能没有更多研究,但这种细胞因子在调节T细胞依赖的应答机制中的作用与在鼠弓形虫感染中的作用机制是相似的。4.5IL-6和IL-1IL-6是由T细胞衍生的一种多效淋巴激活素,能诱导B细胞分化成熟为分泌抗体的浆细胞。鸡IL-6基因与人IL-6基因序列的相似性为35%,用大肠杆菌表达的鸡IL-6,具有生物学活性,能诱导IL-6依赖的鼠杂交瘤细胞系-7TD1增殖。柔嫩艾美耳球虫初次感染的血清中可检测到IL-6样因子的活性。在感染后的前几个小时就能检测到IL-6的活性,说明IL-6这种细胞因子在机体抗球虫获得性免疫形成过程中可能发挥一定作用。分别在给鸡感染柔嫩或巨型艾美耳球虫的同时和感染后分离巨噬细胞,在体外获得了巨噬细胞的分泌产物IL-1,且发现球虫感染鸡的淋巴细胞比未感染球虫鸡的淋巴细胞分泌IL-1的能力强。通过RT-PCR方法检测IL-1mRNA发现,柔嫩或巨型艾美耳球虫感染鸡后7d,IL-1β的转录水平升高27~80倍。但IL-1在机体抗球虫感染免疫形成中的准确作用还需进一步研究。4.6其他细胞因子趋化因子在炎症过程中细胞迁移和正常的白细胞运输中起重要调节作用。外源刺激物和内源调节物,如IL-1、TNF、血小板衍生生长因子(PDGF)和IFN-γ,均能刺激多种细胞分泌产生趋化因子。趋化因子主要分为两类:IL-8和K60是CXC(中文名)类趋化因子,而最近克隆的鸡K203则是CC(中文名)类趋化因子。经脂多糖(LPS)刺激鸡巨噬细胞系HD-11后克隆的K203cDNA,与哺乳动物巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1β)序列同源性达50%。Laurent等研究发现,柔嫩艾美耳球虫感染后,盲肠中CC类趋化因子K203和MIP-1β的mRNA水平分别上调200和80倍,而巨型艾美耳球虫感染后,空肠中K203和MIP-1β的mRNA水平分别上调100和5倍。更有趣的是,CXC类趋化因子IL-8和K60的mRNA水平却没有明显改变。最近,Min等用球虫感染鸡的上皮内淋巴细胞构建了ESTcDNA文库,并筛选鉴定了2个新的球虫细胞因子IL-16和IL-17。由于这2种细胞因子在球虫感染组织含量较高,因此提示他们在抗球虫局部免疫方面发挥潜在作用。最近,对30多种不同细胞因子和趋化因子的分析研究表明,在球虫感染的前期,有多种细胞因子参与调节Th1型细胞的免疫应答,这与已经研究证实的IFN-γ的调节功能相似。机体在球虫病期间分泌产生IL-10,但其在发病过程中的作用还不清楚。因此,对于细胞因子在介导Th1型和Th2型细胞免疫应答中作用的进一步研究,将加深人们对机体抗球虫先天性免疫和获得性免疫机理的认识。5球虫感染的鸡体内no的组织表达及致病性变化生物机体内的NO是免疫细胞参与免疫反应的一种效应分子,在病理条件下能大量产生,可直接或间接抑制和杀死寄生虫等多种病原体。Allen于1994年首次发现球虫病雏鸡的血浆中NO水平明显升高。后来,Allen发现巨型艾美耳球虫病鸡的血浆中NO水平也比健康鸡高,用对柔嫩艾美耳球虫具有免疫力的雏鸡进行的研究也证明鸡体内NO的生成较多,这提示NO在鸡抗球虫感染中可能发挥重要作用。李金贵等采用NADPH-d(Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate-diaphroase)组织化学法观察了雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫后,一氧化氮合成酶(NOS)在盲肠和脾脏中的分布与表达,结果表明,盲肠黏膜上皮和肠腺上皮有诱导型NOS(iNOS)表达,NO水平升高。傅小平等研究表明,日粮中添加NO前体物L-Arg对鸡感染球虫有明显的保护作用,而添加Dex(iNOS抑制剂)不但能降低血浆中的NO水平,还使鸡对球虫的易感性增强;申兆菊等给