不同植物激素对马铃薯愈伤组织诱导及其再生体系的影响

不同植物激素对马铃薯愈伤组织诱导及其再生体系的影响

甘薯是世界上最重要的粮食。我国马铃薯种植面积位列世界第一,但我国马铃薯单产低于世界平均水平,如何提高马铃薯品质和产量有着重大意义。现有马铃薯栽培品种由于遗传背景狭窄,导致通过常规育种技术选育出满足多种用途的品种较难。自1983年首次获得转基因马铃薯以来,短短10余年间,植物基因工程的研究和开发进展十分迅速。转基因技术的应用克服了马铃薯常规育种的不足,为培育具有多种用途,如抗病、高产等新品种提供了可能。在植物转基因技术中,存在着植株再生率低的问题,但由于马铃薯不同基因型之间诱导再生条件存在较大的差异。李凤云等研究10个马铃薯品种无腋芽茎段的愈伤诱导和再生情况发现,品种间的差异达极显著水平,愈伤组织诱导率最低为38.0%,最高为98.7%,再生率最高达到90.3%,最低只有2.1%;且不同品种诱导出的愈伤组织在质地、大小、颜色、生长速度等方面有很大差异,再生过程中芽点数及再生植株的生长状况也不尽相同。蒋敏华等比较了4个马铃薯品种的愈伤诱导率和芽分化率,愈伤诱导最高达64.77%,最低只有27.78%,芽诱导率最高为费乌瑞它,达到11.54%,最低为中薯3号,没有出芽。不同品种间如此大的差异使得对不同品种进行再生系统的筛选具有重要的意义。本研究通过对2个马铃薯品种(夏坡蒂和费乌瑞它)的愈伤和出芽培养基进行筛选,优化了最佳激素配方,为进一步转基因工作奠定了基础。1材料和方法1.1为材料的无菌苗研究以马铃薯品种夏波蒂(Solanumtuberosumcv.Shepody)和费乌瑞它(Solanumtuberosumcv.Favorite)的无菌苗为材料(贵州省生物技术研究所提供)。无菌苗继代培养于MS固体培养基中,取其茎段为外植体材料。1.2方法1.2.1诱导培养基的设计以MS培养基为基本培养基,含3%蔗糖和0.8%琼脂,pH为5.8,121℃高压灭菌22min后,待培养基冷至50~60℃时加入过滤灭菌的玉米素并倒在平皿上,3~7d后无污染即可使用。夏坡蒂愈伤组织诱导培养基采用3因素3水平L9(34)的正交设计试验,3个因素分别为6-BA、NAA、GA3,其激素组合编号为A(表1),夏坡蒂的不定芽诱导培养基激素组合编号为B(表2);在夏坡蒂愈伤和不定芽诱导培养基筛选的基础上对费乌瑞它进行愈伤和出芽培养基筛选,费乌瑞它的愈伤诱导培养基编号为C(表1),不定芽诱导培养基的编号为D(表2)。各处理的水平见表1和表2。1.2.2马铃薯芽分率检测在超净工作台上,取生长健壮苗龄为21~28d的无菌试管苗,选取马铃薯的幼嫩茎段作为外植体进行愈伤组织诱导,切成约0.5cm长的茎段,除去叶片、腋芽及茎尖,留取茎部接种于不同处理的培养基上,培养基为不同浓度的激素组合,14d后统计愈伤数,并观察愈伤状态。筛选出最优激素组合后接种马铃薯茎段外植体进行愈伤培养,愈伤长成后分别转到芽分化培养基上,20~40d后统计芽分化率,愈伤率/%=愈伤外植体/总外植体数。芽分化率/%=分化芽数/总外植体数。愈伤诱导时每个品种每次处理约为90个外植体数,重复3次。1.2.3培训条件试验材料均置于光照培养箱中进行培养。光照强度为22000lx,光周期为12h光照/12h黑暗,培养温度白天24℃,夜晚22℃。2结果与分析2.1受伤因素和芽诱导培养基的筛选2.1.1最佳愈伤培养基的确定从表1看出,夏坡蒂在激素组合A6中,即2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/LGA3时,愈伤率达到100%,同时愈伤比较大,颜色鲜绿色,长势均一,态势好,故其为夏坡蒂的最佳愈伤培养基。在其他激素组合处理中,发现:GA3在5mg/L和10mg/L的处理中,均出现出芽率比较高的态势,且影响其愈伤组织的生成。说明,过高的GA3浓度有促进出芽的作用,但同时抑制了愈伤组织的生成。从不同激素组合下夏坡蒂的出芽率(表2)看出,夏坡蒂在愈伤组织培养14d后转到出芽培养基上进行出芽筛选,18d开始长芽,在组合B5中,长芽多,分化早,且芽诱导率高。综合各个组合的出芽效果,观察到在玉米素浓度为2mg/L的组合中,其芽分化早,且芽诱导率相对高,芽状态好。这些结果说明,玉米素(ZT)在夏坡蒂不定芽诱导过程中有一定的作用。2.1.2培养基的选择虽然费乌瑞它在组合C1、C4、C5中的愈伤率都达到100%,但在C5上其愈伤组织为最佳状态,愈伤组织大,且其表面多为颗粒状愈伤,有利于植株的再生,故选择C5为其最佳愈伤培养基,同时也得出过高的NAA浓度不利于其愈伤的形成。费乌瑞它出芽率在2mg/LZT+2mg/L6-BA+5mg/LGA3处理组合中最高,达到53.6%。同时观察到,在含有2mg/L玉米素的培养基中出芽状态普遍较好,愈伤组织大。由此得出,玉米素(ZT)有利于费乌瑞它的愈伤和不定芽诱导。2.2再生马铃薯苗的确定将分化出的不定芽切割下来直接培养在不含任何激素的MS固体培养基中进行根的诱导,7d左右可观察到根的发生,2个马铃薯品种不定芽诱导生根率均为100%,当芽苗长出7~8条根时,将发育良好的再生苗从培养瓶中取出,冲去附着的培养基并移栽于盛有经消毒处理的营养土中,加盖塑料膜保温保湿,5~7d后揭去塑料薄膜,定期浇水,炼苗。移栽结果表明,两品种移栽成活率均可达95%以上。3诱导率1)本研究参考前人研究的培养基配方进行试验,对夏坡蒂和费乌瑞它的愈伤组织诱导和不定芽培养基进行了探讨。结果表明,夏坡蒂和费乌瑞它的最佳愈伤组织诱导培养基分别为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+GA30.5mg/L和MS+ZT2.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L,诱导率均达100%。夏坡蒂和费乌瑞它不定芽的最佳诱导培养基分别为MS+ZT2.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA35mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+ZT2.0mg/L+GA35mg/L,诱导率分别达到52.38%和53.6%。结果同时表明,玉米素有助于费乌瑞它的愈伤和不定芽诱导,与张宁等的报道相符,但其结果也存在一定的差异。在夏坡蒂愈伤和芽诱导培养基筛选的基础上对费乌瑞它进行愈伤和出芽筛选,结果发现,费乌瑞它的愈伤率普遍较高。说明,不同马铃薯品种间的激素组合有一定的相关性,应用上可以起到互相指导的作用,减少筛选工作量,但费乌瑞它的最佳激素组合不同于夏坡蒂,进一步分析夏坡蒂分别在费乌瑞它的最佳培养基C5和D3中的愈伤率和出芽率为81.5%和13.2%,而筛选的夏坡蒂最佳愈伤及不定芽诱导培养基的效率则为100%和52.38%。比较夏坡蒂和费乌瑞它的愈伤情况发现,夏坡蒂的愈伤时间及生芽时间都比费乌瑞它短,且它们的最佳愈伤激素组合浓度也不同。说明,不同品种间基因型差异对其再生所需激素组合及再生状况都存在一定的影响。试验过程中还发现,取材部位对愈伤组织诱导有着一定的影响,取健壮植株茎的基部、中部、上部分别接种到相同的培养基上,在相同的培养条件下进行培养,结果发现,取茎段中部进行愈伤组织的诱导,出现愈伤较早,并且愈伤形成量较多,愈伤长势较好;取茎段基部进