烧伤后淋巴细胞肌醇脂质信号系统活性的变化

烧伤后淋巴细胞肌醇脂质信号系统活性的变化

（3）自然资源项目（批准号39500149）。②重庆第三军医大学临床检验教研室,重庆400038大面积深度烧伤后,患者死亡率仍然很高。随着对伤后机体生理改变和液体复苏等方面认识的加深,感染已成为人们关心的最主要问题。虽然引起感染的最直接原因主要是皮肤屏障功能的损伤和肠源性感染,但烧伤后机体免疫功能受损应该是引起感染的重要内在因素。我们清楚,T淋巴细胞是机体细胞免疫功能的重要载体和执行细胞。大面积深度烧伤后,机体免疫系统包括多种免疫活性细胞和体液免疫均发生了不同程度的改变,具体表现为特异性细胞免疫功能受抑和非特异性炎症反应亢进两方面,而细胞免疫受抑又以T细胞功能受抑尤为突出,故可以肯定细胞免疫功能受损应该是严重烧伤后并发感染及其他并发症的重要原因。早期研究表明,烧伤后机体受损的T细胞功能以IL-2、IFN-γ分泌降低和IL-4、IL-10分泌增加为主要特征。最近,烧伤后TH1/TH2平衡的破坏被认为是伤后机体免疫紊乱的主要机制,但导致TH1/TH2平衡漂移的原因尚未得到阐明。近十年来,基础研究对T淋巴细胞活化的信号转导机制已经阐明,即肌醇脂质信号系统是T淋巴细胞活化和执行功能的最主要信号途径。虽然过去对烧伤后机体T细胞功能改变报道较多,但从信号转导入手系统地分析T细胞功能受抑的分子机制尚鲜有报道,本文以18%Ⅲ度烫伤小鼠为模型,对T细胞功能受抑的分子机制进行探讨。1材料和方法1.1小鼠uf-t-uf4/hsb型热蒸汽损伤tba度昆明种小鼠60只,雌雄各半,体重23～26g,随机分为正常对照、伤后2、12、24、96、168h共6组,每组10只。将小鼠背部剪毛,清醒状态下高压热蒸汽造成18%TBSAⅢ度烫伤(病理切片证实)。伤后腹腔注射等渗盐水3ml预防休克,各组动物于相应时相腋动脉放血活杀,无菌制备脾淋巴细胞悬液。1.2t细胞的分离参照文献方法,以尼龙毛纤维分离细胞悬液中的T细胞,酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)染色,96%以上为T细胞,台盼蓝染色证明分离出T细胞存活率>95%。1.3指标的识别和方法1.3.1胞浆ptk提取物的制备取1ml分离纯化调浓度至3×106ml-1的T细胞悬液,ConA5×10-3g/L刺激15min,离心去上清后立即悬于4ml浆PTK提取液(10mmol/LTris-HClpH7.4,1mmol/LMgCl2、1mmol/LEDTA、10mmol/LDTT、1mmol/LPMSF、50×10-3g/LAprotinin、体积分数为10%Glycerol),冰浴中超声破碎(250mA、20s×3)4℃,7000g离心,除去细胞核及完整细胞。上清37000g,4℃离心1h,所得上清即为胞浆PTK提取物(-20℃冻存备测蛋白含量及酶活性);沉淀复悬于膜溶解液中[20mmol/LMg(AC)2,5mmol/LNaF,0.2mmol/LEDTA,0.8mmol/EGTA,1mmol/LDTT,质量浓度为0.5%NP-40,50mmol/LTris-HClpH7.5],置冰上提取1h,期间于冰溶中250mA超声3次,每次10s,再次4℃,37000g离心1h,获得上清即为膜性PTK提取物。活性测定参照KongSK方法进行,考马斯亮蓝G-250测定蛋白含量。1.3.2可溶性酶检测方法同样取新鲜分离纯化调浓度至3×106ml-1T细胞悬液1ml,ConA5×10-3g/L刺激15min,离心去上清,加入4℃预冷缓冲液A(50mmol/Lβ-2Me,1mmol/LPMSF、1mmol/LEGTA、2.5mmol/LMgCl2、0.34mol/L蔗糖、10mmol/LTris-HClpH7.5)4ml,超声破碎(300mA,20s×3),37000g,4℃离心60min,收集上清,上清即含胞浆可溶性酶。离心沉淀部分加入含0.1%TritonX-100(体积分数)匀浆缓冲液(其它成分同缓冲液A),4℃冰箱静置1h,37000g,4℃离心60min,收集上清,上清液即含转膜部分可溶性酶,活性测定参照文献进行。1.3.3pi-蒙古国的分离和活性测试PI-PLC分离及活性测定均参照张泽林等方法进行。1.3.4游离ca++浓度[ca++]io和传感器合成产物分别测定伤后脾脏T淋巴细胞未接受刺激的胞浆游离Ca++浓度[Ca++]io和ConA刺激后Ca++浓度[Ca++]ia,测定方法为Fura-2/AM荧光探针法。1.3.5il-2,il-10含量各取5×106ml-1纯化T细胞悬液0.5ml,加入10×103g/LConA0.5ml混匀,在体积浓度为5%的CO2、37℃孵箱培养24h,离心收集上清,ELISA法测定IL-2、IL-10含量(试剂购自深圳晶美公司)。1.3.6新鲜配制的mtt按MTT比色法稍加改进进行检测。即在培养的最后4h每孔加入新鲜配制的浓度为5g/L的MTT10μl。移出上清,加入100μl乙醇放置30min显色,酶标仪上570nm测定。1.4处理数据结果均以ˉx±s表示,采用STAT5.0统计程序处理,包括行方差分析、方差齐性检验和t检验相关分析。2t细胞肌醇磷脂途径胞浆信号转导分子活性/浓度变化2.1烧伤后脾脏T淋巴细胞肌醇磷脂途径跨膜信号转导酶PTK、G-Protein及转膜PKC活性变化与正常对照相比,烧伤后T细胞G-protein,PTK活性均于伤后2h即出现明显降低,伤后12、24h降低非常显著,伤后168h出现回升,二者变化趋势较一致;转膜PKC活性出现双相改变,即伤后2～12h降低,伤后96h及以后升高(表1)。2.2烧伤后T淋巴细胞肌醇磷脂途径胞浆信号转导分子活性/浓度变化参与介导烧伤后T细胞胞内信号转导各分子活性变化较复杂,具体表现在与正常对照组相比胞浆PKC活性出现先升高(12h,P<0.01),后降低(96h,P<0.01)的双相改变,与转膜PKC变化趋势相反,其活性改变与IL-10分泌呈负性直线相关;PI-PLC活性和Ca++浓度伤后各时相均降低,但变化趋势一致,二者均于伤后168h出现恢复(表2,表3)。2.3烧伤后T淋巴细胞功能活性与正常对照组相比较,烧伤后小鼠脾脏T细胞增殖能力减弱,明显减弱出现于伤后12h,伤后24、96h显著减弱,IL-2的分泌于伤后明显降低,伤后24～168h降低有非常显著性意义(P<0.001),IL-10的分泌出现先降低后升高的变化趋势,降低出现于伤后2～96h,升高出现在伤后168h及以后。相关分析结果(rCa++/IL-2=0.581,rPI-PLC/IL-10=0.753)表明:胞浆[Ca++]与IL-2分泌及PI-PLC活性与IL-10分泌呈非常显著正相关。3损伤后t细胞功能变化与信号转导活性的变化严重烧伤患者由于其机体天然和获得性免疫功能紊乱,其导致感染的易感性大大增加。天然免疫功能的损伤包括皮肤屏障的破坏,肠源性感染和巨噬细胞功能降低等;获得性免疫功能的损伤则主要是对T淋巴细胞功能的破坏,包括T细胞IL-2分泌减少和增殖功能降低等。此外,烧伤后免疫紊乱还包括非特异性炎症反应亢进和由此导致的诸多并发症等。最近的资料显示,动物和人体实验均证明,烧伤和创伤后机体T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2降低,而IL-10、IL-4的产生却增加,故由此推论,烧伤和创伤后可诱发机体TH1/TH2平衡破坏。众所周知,IL-2是T细胞必需的生长因子,而IL-10是机体细胞免疫反应的重要抑制因子,其抑制活性体现在对辅助细胞合成分泌IL-1β、IL-12(TH1细胞)的抑制和抑制单核细胞、巨噬细胞功能等方面。即伤后机体细胞因子的分泌可以诱导和加重机体的免疫抑制。我们的实验同样证实了上述结果。具体表现为,严重烧伤后常诱导机体TH1/TH2平衡偏向TH2型反应为主(TH2细胞增殖分化增强而TH1细胞增殖分化减弱)。为探索伤后T细胞的细胞因子分泌改变(TH1/TH2平衡偏移)和功能受抑的分子机制,我们对伤后T淋巴细胞信号转导活性进行研究。T细胞的活化和功能的执行可以由丝裂原介导,而在体内更主要的是接受抗原递呈细胞呈递的抗原信号和MHC(Ⅰ、Ⅱ)类信号,在共刺激分子如CD28作用下活化、增殖、分泌细胞因子,执行相应的免疫功能。T淋巴细胞活化过程涉及信号接收、跨膜转导、胞内传导、信号入核和基因表达等多个方面。本研究以肌醇磷脂信号途径为对象,探索严重烧伤后T细胞功能受抑的分子机制。全面分析本实验结果可以发现:①严重烧伤后,T细胞跨膜信号转导处于T细胞活化信号流的“限速酶”地位,也即参与跨膜信号转导的G-Protein、PTK、转膜PKC活性受抑是制约烧伤后T细胞活化信号转导的“瓶颈”。G-Protein、膜PTK伤后各时相和转膜PKC伤后早期活性均降低,其变化趋势与淋巴细胞增殖反应和IL-2分泌变化趋势相一致;且该三个信号转导酶在诸多信号转导分子中活性明显降低的时相发生最早。②严重烧伤后,PKC转膜可以独立于PI-PLC作用底物DAG。原因在于:PKC是由PI-PLC分解PIP2所产生底物DAG活化,为PI-PLC下游信号分子,其活性变化应尾随PI-PLC的活性变化,与同属PI-PLC作用主物IP3介导的[Ca++]浓度相一致。但我们的研究结果显示其活性变化早于PI-PLC和Ca++,提示存在有活化PKC的另外途径,且说明PKC转膜可以独立于PI-PLC作用底物DAG。另外,转膜PKC出现先降低后升高,其变化趋势与IL-10分泌相一致,提示二者可能存在某种相关性。③烧伤后脾脏T淋巴细胞胞浆Ca++浓度降低可能是导致T细胞增殖活性降低和IL-2分泌减少的重要原因,但伤后168hCa