医学分子生物学：癌基因与肿瘤抑制基因

癌基因与肿瘤抑制基因OncogeneandTumorsuppressorgene2正调控信号：促进细胞生长和增殖，并且阻止其发生终末分化——癌基因负调控信号：促进细胞成熟，向终末分化，最后凋亡——肿瘤抑制基因两种信号保持着动态平衡，对正常细胞的生长、增殖、死亡精确地调控当平衡被破坏，正调控信号基因功能过盛或负调控信号基因失活，导致细胞增殖调控的混乱而使细胞恶变正常细胞的生长增殖由两大基因调控3癌基因与肿瘤抑制基因的关系癌基因肿瘤抑制基因细胞生长因子类正调控负调控产物生长抑制因子类产物癌基因和肿瘤抑制基因在细胞增殖中的作用4在基因水平上促使细胞增殖及凋亡失衡，

导致细胞恶性变的原因有：①控制细胞增殖的原癌基因活化或肿瘤抑制基因失活；②促细胞凋亡的基因失活或抑制凋亡的基因功能增强；③DNA修复基因失活，使突变在细胞内积累，并且累及到调节细胞增殖及细胞凋亡的基因。56肿瘤发生学说多种致癌因素综合作用的结果

物理因素(如紫外线、电离辐射等)

化学因素(如黄曲霉毒素)

生物因素(DNA或RNA病毒)

肿瘤是经多次打击、多步骤、多阶段变化而发生的疾病7initiationprogresssionpromotion8人类结直肠癌的发展需要5～6个步骤、多阶段或多次打击而发生的APC肿瘤抑制基因突变K-ras癌基因的突变肿瘤抑制基因DCC的失活c-myc基因的过度表达p53基因的失活是这些变化的积累，多次打击促进了肿瘤的形成9癌基因PartⅠ11肿瘤标志物的研究历史第1阶段(1978以前)：癌胚性抗原1963年AbelevAFP1965年Gold&FreemanCEA第2阶段(1979-1989)：糖链抗原为主1980年Koprowski

CA19-91981年Bastetal

CA125第3阶段(1990以后)：肿瘤基因标志121911Rous

肿瘤病毒鸡肉瘤上清1966Nobel1960Huebner病毒肿瘤基因1970MartinRous肉瘤src基因(v-src)1976

Bishop

原癌基因

1989Nobel1984

Murphree抑制肿瘤生长基因Rb1987Lee

肿瘤抑制基因1988Steeg肿瘤转移抑制基因nm23

鼠黑色素瘤1989Verbalize肿瘤转移基因mts1

鼠乳腺肉瘤肿瘤基因标志物研究简史13癌基因的发现1911年Rous发现鸡肉瘤病毒(RSV)——RNA逆转录病毒1963年Dulbecco发现正常细胞感染病毒可恶变为癌细胞1970年Baltimore发现病毒感染宿主时，RNA经逆转录酶合成cDNA并整合到宿主DNA，从而导致宿主细胞的恶性转化1970年Martin证明细胞恶性转化与RSV基因组中一个特定的基因src相关，该基因被命名为病毒癌基因(v-oncogene,v-onc)，即v-src141977年Bishop证明正常细胞中存在与v-oncogene同源序列——细胞癌基因(cellularoncogene,c-onc)；与v-src对应者名为c-src80年代初Weinberg等几个实验室通过转染实验证明人体细胞中的癌基因H-ras现已发现100多种的细胞癌基因15癌基因(oncogene)基因组内正常存在的基因，其编码产物通常作为正调控信号，促进细胞的增殖和生长。癌基因结构异常或表达异常是细胞恶性转化（癌变）的重要原因。一、癌基因的基本概念16癌基因最早在可导致肿瘤发生的病毒中被鉴定；后来的研究发现，这些基因原本就存在于大部分生物的正常基因组中。所以癌基因包括细胞癌基因(cellularoncogene，c-onc)或原癌基因(proto-oncogenes，pro-onc)，以及存在于病毒中的被称为病毒癌基因(virusoncogene，v-onc)。癌基因的名称一般用斜体字母表示：myc、ras、src等凡能编码生长因子、生长因子受体、细胞内生长信号转导分子以及与生长有关的转录调节因子等的基因。广义的“癌基因”1718(一)细胞癌基因(c-onc)/原癌基因

(proto-onc)

存在于生物正常细胞基因组中的癌基因也称细胞癌基因(cellularoncogene,c-onc)将存在于正常细胞内未被激活的癌基因，即与病毒癌基因具有同源性的细胞癌基因也称为原癌基因(proto-oncogene)19广泛存在于生物界基因序列高度保守是基因的正常版本，是活化的癌基因的前体，表达产物对细胞正常生长、繁殖、发育和分化起着精确的调控作用，是生长发育过程中所不可缺少的。基因结构发生异常或表达失控，导致细胞生长增殖和分化异常。概念20细胞癌基因/原癌基因在发育过程中的一定时间、一定组织中定量的表达，产生生命活动中所必需的蛋白质，促进某些生命过程的进行，使生长发育得以实现。正常情况下，这些细胞癌基因/原癌基因在机体生长发育过程完成后多处于关闭状态，即不表达或低表达。一旦在错误的时间，不恰当地点，不适量表达即可能导致细胞无限制的增长而趋于恶性转化。类别癌基因名称作用生长因子类SISPDGF-2INT-2FGF同类物，促进细胞增殖蛋白酪氨酸激酶类生长因子受体EGFREGF受体，促进细胞增殖HER-2EGF受体类似物，促进细胞增殖FMS、KITM-CSF受体、SCF受体，促增殖膜结合的蛋白酪氨酸激酶SRC、ABL与受体结合转导信号细胞内蛋白酪氨酸激酶TRK在细胞内转导信号细胞内蛋白丝/苏氨酸激酶RAFMAPK通路中的重要分子与膜结合的GTP结合蛋白RASMAPK通路中的重要分子核内转录因子MYC促进增殖相关基因表达FOS、JUN促进增殖相关基因表达人体内细胞癌基因的分类及功能举例

21功能上相关的癌基因家族分类SRC家族：产物多具有酪氨酸蛋白激酶活性，能促进增殖信号的转导。

RAS家族：编码小G蛋白p21，参与cAMP水平的调节。

MYC家族：编码核内DNA结合蛋白，调节其他基因转录的作用。SIS家族：编码的p28，能刺激间叶组织的细胞分裂繁殖。MYB家族：核内转录因子2223原癌基因一类编码关键性调控蛋白质的正常细胞基因，发生恶变后转变为癌基因的基因序列。生长因子

生长因子受体

GTP酶

蛋白激酶

核蛋白

DNA合成siserbAmosablerbByesfmssrcrasmycmybfosjunskiros2425(二)病毒癌基因(virusoncogene,v-onc)癌基因最早发现于逆转录病毒中。1911年，Rous医生首次提出病毒引起肿瘤，但直到上一世纪50年代才得到实验证实，命名为罗氏肉瘤病毒(RousSarcomaVirus，RSV)。病毒癌基因序列在病毒基因组中不编码病毒的结构成分，对病毒的复制也没有作用。在正常情况下，病毒癌基因无活性，一旦受到外界刺激如辐射或化学致癌剂的影响，就会全部或部分活化，产生转化作用，可以使细胞持续增殖，诱导肿瘤的发生。

调节和启动转录LTR

gag

pol

env

srcLTR

长末端重复序列癌基因正常的病毒基因产生病毒核心蛋白产生逆转录酶和整合酶

产生病毒外膜蛋白产生酪氨酸激酶26病毒基因组结构27逆转录病毒如何获得细胞癌基因病毒癌基因v-src来源于宿主细胞的c-src基因2829病毒癌基因在其名称前冠以前缀“v”，如v-ras；细胞癌基因在其名称前冠以前缀“c”，如c-rasv-onc是病毒基因组中特殊的核苷酸序列，能引起细胞转化；

c-onc是存在于正常细胞基因组中的癌基因，在正常情况下处于静止或低表达的状态，不仅对细胞无害，而且对维持细胞正常功能具有重要作用，但在异常表达时，其产物可使细胞无限制分裂。

病毒癌基因(v-onc)与细胞癌基因(c-onc)30病毒癌基因与细胞癌基因细胞癌基因与病毒癌基因核酸序列有同源性(即它们的DNA序列是相对应的)，表达产物也基本相同但二者的同源序列有一定程度的差异病毒癌基因在两端通常有序列的丢失病毒癌基因无内含子，细胞癌基因通常有内含子或插入序列病毒癌基因常会出现碱基取代或碱基缺失3132正常细胞肿瘤细胞逆转录病毒感染细胞后，病毒基因组所携带的长末端重复序列（LTR内含较强的启动子和增强子）插入到细胞原癌基因附近或内部,启动下游邻近基因的转录和影响附近结构基因的转录水平，使原癌基因过度表达或由不表达变为表达，从而导致细胞发生癌变。33(一)获得启动子与增强子二、癌基因活化的机制34获得强启动子增强子插入至关键基因在染色体易位的过程中发生了某些基因的易位和重排，使原来无活性的原癌基因移至强的启动子或增强子附近而被活化，原癌基因表达增强，导致肿瘤的发生。35(二)染色体易位原癌基因可通过基因扩增基因拷贝数可升高几十甚至上千倍不等，发生扩增的机制目前尚不清楚。基因扩增可致编码产物过量表达，细胞发生转化。36(三)基因扩增原癌基因在射线或化学致癌剂作用下，发生单个碱基的替换——点突变，从而改变了表达蛋白的氨基酸组成，造成蛋白质结构的变异。37(四)点突变癌基因活化的4种机制示意图3839获得强启动子与增强子染色体易位：调控原件丢失基因扩增点突变调控差异导致产物过表达结构差异导致产物活性和功能发生改变原癌基因活化为癌基因40癌基因被激活的结果出现过量的正常表达产物出现新的或截短的异常的表达产物41根据逆转录病毒癌基因整合部位的分析DNA转染和转化实验根据染色体易位根据同源性分析：基因扩增、突变、DNA甲基化等三、癌基因的鉴定方法42DNA转染和转化实验4344在染色体易位的过程中发生了某些基因的易位和重排，使原来无活性的原癌基因易位到强的启动子或增强子附近而被活化，或与其他高表达基因形成融合基因，原癌基因表达增强，导致肿瘤的发生。CML：t(9;22)9q+和22q-(Ph1)BL：t(8;14)8q-和14q+染色体易位45染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到第22对染色体上，重排形成bcr-abl融合基因该融合基因使表达增高，蛋白质产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增加，导致慢性粒细胞白血病的发生46人c-myc基因定位于8q24，可易位到IgH(定位于14q32)、Igκ(定位于2p12)、Igλ(定位于22q11)基因的高活性转录区，从而组成一个c-myc基因的高转录活性的重排基因，启动c-myc转录，使c-myc基因表达增强，促进细胞恶变，最终导致肿瘤的发生。47Chromosomaltranslocationscommonly

occurringinhumantumors48细胞周期中DNA复制数次，导致原癌基因拷贝数量的增加超出了正常细胞原癌基因的拷贝数基因产物的增加，从而使细胞正常功能紊乱原癌基因扩增49细胞学：均质染色区(HSR)——染色体某个节段相对解旋，浅染区，染色体增长双微体(DM)——扩增的DNA脱离染色体，分散、成双的染色质小体分子水平：基因拷贝数倍增(相应的mRNA和蛋白质产物也都大量增加)50均质染色区(HSR)和双微体(DM)5152Oncogenamplificationinhumantumors53点突变54K-ras、N-ras、H-ras：12、61codon突变55PointmutationsidentifiedinhumantumorsDNA分子中的甲基化(methylation)对阻抑基因的转录具有重要作用56原癌基因甲基化程度降低而激活与肿瘤诊断有关的癌基因在肿瘤中较普遍表达：c-myc、c-fos、H-ras在肿瘤中特异性表达：白血病：abl、ras多发性结肠息肉：c-myc结肠癌，胰腺癌，肺癌：ras乳腺癌，卵巢癌：brcA1、erbB-2临床意义尚不明确：c-mos、cyes、cfps、c-sac等57原癌基因的产物及其功能PartⅡ原癌基因在细胞内的分布59参与细胞生长调控的原癌基因的产物编码产物分布于细胞的不同部位，依其编码产物功能分类细胞的生长信号——生长因子：sis、PDGF生长因子受体：erbB、EGFR细胞内信号转导体：Src、Ras、Raf、PKC核内转录因子：erbA、Jun、Fos、myc、NF-κB其他6061概念：通过质膜上特异的受体，将信息传递至细胞内部，调节细胞生长与增殖的多肽类物质作用：通过细胞膜上的受体系统或直接被传递至细胞内，介导蛋白激酶活化转录因子，引发一系列基因的转录激活例如：

c-sis和PDGFB链高度同源，sis基因表达的蛋白p28和PDGF一样能促进血管的生长一、细胞外生长因子生长因子(growthfactor)sis家族定位：人类第22号染色体，5个外显子编码：241个氨基酸的蛋白质(p28)特点：与人类的血小板衍生生长因子(PDGF)有87%的同源性，可与PDGF受体(PDGFR)结合62作用：PDGF能促进结缔组织细胞及神经胶质细胞的增殖，故Sis作用于PDGFR，可刺激细胞的生长及增殖。Sis636465生长因子作用机制示意图作用：接受细胞外的生长信号而被激活，通过激酶活性、结构改变等方式促进生长信号在细胞内的传递。例如：

erbB和EGFR基因产物的氨基酸序列几乎相同二、跨膜生长因子受体生长因子受体

(growthfactorreceptor)66与野生型受体相比，跨膜区域无变化，但受体的两端变短，尤其是缺失全部胞外结构区域67erbB家族蛋白质酪氨酸激酶类受体：EGFR、IGFR、HGFR非酪氨酸蛋白质激酶受体：如丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G蛋白偶联受体分类68蛋白质酪氨酸激酶类受体69EGFR作用机制70HER2是表皮生长因子受体家族成员，具有蛋白酪氨酸激酶活性，能激活下游信号通路，从而促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。在30%的乳腺癌中HER2基因发生扩增或者过度表达，其表达水平与治疗后复发率和不良预后显著相关。71G蛋白偶联受体72原癌基因的产物或者由其作用产生的第二信使作为胞内转导体，将接受到的生长信号由胞内传至核内，促进细胞生长。胞内转导体的原癌基因的产物非受体酪氨酸激酶：c-Src、c-Abl丝氨酸/苏氨酸激酶：c-RafG蛋白(三聚体及Ras蛋白：H-ras，K-ras和N-ras)三、细胞内信号转导分子73(一)非受体酪氨酸激酶Src亚家族——非受体型PTK的结构定位：c-src定位于第20号染色体，17个外显子编码：60kDa的蛋白质，具蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase,PTK)活性作用：通过激酶的磷酸化作用，使底物的结构发生改变，增加激酶对底物的活性，加速生长信号在胞内的传递，与细胞无限生长关系密切74Src蛋白的结构简图及其活性调控P调控区催化区SH3SH2416Tyr527Tyr-催化区SH3调控区SH2527Tyr催化区SH3调控区SH2P失活状态激活状态激活状态527TyrP416Tyr-416Tyr416Tyr-75蛋白相互作用结构域缩写识别模体Srchomology2SH2含磷酸化酪氨酸模体Srchomology3SH3富含苯丙氨酸模体pleckstrinhomologyPH磷脂衍生物ProteintyrosinebindingPTB含磷酸化酪氨酸模体WWWW富含脯氨酸模体蛋白相互作用结构域及其识别模体76蛋白激酶BtkPHTHSH3SH2催化区衔接蛋白Grb2SH3SH2SH3转录因子statDNA结合区SH2TA细胞骨架蛋白tensin//SH2PTB信号转导分子中的蛋白相互作用结构域的分布和作用77慢性粒细胞白血病患者的9号染色体与22号染色体之间发生易位，从而融合产生了癌基因BCR-ABL，编码的蛋白质Bcr-Abl具有持续活化的蛋白酪氨酸激酶活性，能促进细胞增殖，并增加基因组的不稳定性。在95%的慢性粒细胞白血病患者中都伴随有BCR-ABL融合基因的产生，在一些急性淋巴白血病患者中也有发现。78BCR-ABL(二)丝氨酸/苏氨酸激酶丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶：Raf、PKC、MosRaf蛋白：N端结合Ras，C端结合并磷酸化MEK、MAPK、MAPKKPKC蛋白：N端调控区，结合Ca2+和DG后被激活；C端活性区Mos蛋白：只在生殖细胞内表达，不含调节区域，下游底物也是MAPK等79催化结构域Ca2+DG磷脂酰丝氨酸调节结构域催化结构域底物Ca2+DG磷脂酰丝氨酸调节结构域假底物结合区DG活化PKC的作用机制示意图8081原癌基因BRAF所编码的蛋白质属于丝/苏氨酸激酶，是MAPK信号通路的重要组成分子，在调控细胞增殖、分化等方面发挥重要作用。约60%的黑素瘤中BRAF发生突变，其第600位氨基酸从缬氨酸突变为谷氨酸（V600E）最为常见，导致B-Raf的持续激活。82BRAFα亚基(Gα)β,γ亚基(Gβγ)具有多个功能位点α亚基具有GTP酶活性与受体结合并受其活化调节的部位βγ亚基结合部位GDP/GTP结合部位与下游效应分子相互作用部位主要作用是与α亚基形成复合体并定位于质膜内侧；在哺乳细胞，βγ亚基也可直接调节某些效应蛋白。(三)G蛋白1.三聚体G蛋白83RＲHACγαβGDPαGTPβγ腺苷酸环化酶ACATPcAMP84ＲRHACγαβGDPαGTPACcAMPβγ腺苷酸环化酶85862.Ras蛋白低分子量G蛋白或称为单体G蛋白ras家族成员：H-ras、K-ras、N-ras(H-ras、K-ras分别来自大鼠肉瘤病毒Harvey、Kirsten株；N-ras从人神经母细胞瘤中获得)

编码特点：4个外显子组成，编码的氨基酸顺序有85%的同源性，主要位于细胞膜的内侧面，蛋白质大小为21kD功能：参与细胞增殖信号的细胞内转导过程，是维持细胞生长和分化的重要信号转换器87Ras蛋白的活性调控8889Grb2及Sos在Ras蛋白激活途径中的作用90MAPKKKMAPKKMAPK

ThrTyrThrTyrPPphosphataseoffonMAPK91

MAPK级联激活是多种信号通路的中心环节92调控基因表达的最为直接的因子是核内转录因子，位于核内，属反式作用因子，可与某些特定的靶基因的顺式调控元件相结合，调控基因的复制、转录某些转录因子其活性水平的变化可直接影响细胞的生长、分化和增殖，从而使细胞发生转化、诱发肿瘤例如：类固醇类激素受体基因、c-jun、c-fos、c-myc、NF-κB四、核内转录因子核受体结构及作用机制示意图93Jun和Fos对基因活化的调控94NF-

B信号转导通路95细胞外生长因子跨膜的生长因子受体细胞内信号传导体核内转录因子96细胞周期调节因子促进肿瘤新生血管形成的基因抗凋亡基因肿瘤转移相关基因端粒酶染色质修饰基因97其他肿瘤相关基因肿瘤抑制基因PartⅢ肿瘤抑制基因也是调节细胞正常生长和增殖的基因，其生物学功能与癌基因相反：其基因表达产物对细胞的生长和增殖起负调控作用，并能抑制细胞的转化。当肿瘤抑制基因出现纯合缺失、突变等异常不能表达，或者其表达产物失去活性时，细胞就会异常生长和增殖，最终导致细胞恶性转化而发生肿瘤。反之，若导入或激活肿瘤抑制基因则可抑制细胞的恶性表型。肿瘤抑制基因(tumorsuppressorgene)99又称为隐性癌基因(recessiveoncogenes)

抑癌基因或抗癌基因(anti-oncegene)肿瘤易感基因(tumorsusceptibilitygenes)100该恶性肿瘤的相应正常组织中该基因必须正常表达该恶性肿瘤中这种基因应有结构改变或表达缺陷、或功能失活将这种基因的野生型导入基因异常的肿瘤细胞内，可部分或全部改变其恶性表型肿瘤抑制基因理论上的三个基本条件101正常细胞肿瘤细胞非肿瘤型杂交细胞杂交融合肿瘤细胞1肿瘤细胞2杂交融合非肿瘤型杂交细胞肿瘤细胞导入染色体肿瘤细胞恶性表型抑制102一、肿瘤抑制基因的发现细胞杂交试验正常细胞失去某些基因肿瘤细胞

基因1基因2原癌基因

MW

肿瘤肿瘤抑制基因MW

MM肿瘤103二次打击假设二、遗传性视网膜母细胞瘤三、肿瘤抑制基因的杂合性丢失104肿瘤抑制基因的产物及其功能PartⅣ肿瘤抑制基因的产物及其功能肿瘤抑制基因的表达产物：主要包括结构蛋白，跨膜受体，胞质信号转导因子，转录因子，转录调节因子，细胞周期因子，DNA损伤修复因子等等。功能：主要参与细胞生长增殖的负调控，即可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用。106常见的肿瘤抑制基因107名称染色体定位相关肿瘤编码产物及功能TP5317p13.1多种肿瘤转录因子p53，细胞周期负调节和DNA损伤后凋亡RB13q14.2视网膜母细胞瘤、骨肉瘤转录因子p105RbPTEN10q23.3胶质瘤、膀胱癌、前列腺癌、子宫内膜癌磷脂类信使的去磷酸化，抑制PI3K-Akt通路P169p21肺癌、乳腺癌、胰腺癌、食道癌、黑素瘤p16蛋白，细胞周期检查点负调节P216p21前列腺癌抑制Cdk1、2、4和6APC5q22.2结肠癌、胃癌等G蛋白，细胞黏附与信号转导DCC18q21结肠癌表面糖蛋白（细胞黏附分子）NF17q12.2神经纤维瘤GTP酶激活剂NF222q12.2神经鞘膜瘤、脑膜瘤连接膜与细胞骨架的蛋白VHL3p25.3小细胞肺癌、宫颈癌、肾癌转录调节蛋白WT111p13肾母细胞瘤转录因子108一、肿瘤抑制基因失活促进肿瘤发生发展G0G1期Rb蛋白E2F-1S期E2F-1mRNADNAPRb蛋白(一)视网膜母细胞瘤基因(RB基因)109RB基因的生物学功能Rb磷酸化与细胞周期控制110Rb蛋白与病毒的结合作用SV40病毒大T抗原腺病毒5型E1A癌蛋白均能与磷酸化的Rb蛋白结合形成稳定的复合物Rb蛋白失活抑制细胞正常生长的作用丧失111位于17p13.1，DNA20kb，含有11个外显子(exon1不编码，exon2、4、5、7、8分别编码5个进化上高度保守的结构域)，mRNA2.5kb112(二)TP53基因p53蛋白：393个氨基酸组成的核蛋白，分子量53kD，定位于核内，能与DNA特异性结合，具有转录因子的作用N端酸性区——激活转录区中间疏水区——DNA结合区C端碱性区——寡聚化区p53蛋白的结构113p53蛋白解链酶复制因子Ap21蛋白细胞停滞于G1期细胞调亡酸性区核心区碱性区p53蛋白DNA损伤p21基因p53蛋白抑制p53蛋白成功修复修复失败p53蛋白的生物学功能114p53的结构及其在清除DNA损伤细胞中的作用115TP53基因突变不仅失去野生型p53抑制肿瘤增殖的作用，而且突变本身又使该基因具备癌基因功能。突变的p53蛋白与野生型p53蛋白相结合，形成的这种寡聚蛋白不能结合DNA，使得一些癌变基因转录失控导致肿瘤发生。116117DNAdamage

p53Inhibitionofcyclin/Cdkcomplexes

PCNA

bax

fas

bcl-2ReactiveoxygenspeciesCell-cyclearrestatG1ApoptosisInhibitionofDNArepl