乳酸杆菌对小鼠宫颈鳞癌u14的抗癌作用及细胞凋亡的诱导作用

乳酸杆菌对小鼠宫颈鳞癌u14的抗癌作用及细胞凋亡的诱导作用

宫颈是一种常见的妇科肿瘤，近年来其发病率有所增加。应用微生物法治疗肿瘤是新的研究热点之一。乳酸杆菌(Lactobacillus,LB)作为新型生物反应调节剂,具有抗多种肿瘤作用,但对宫颈癌的抗癌作用未见报道。本动物实验研究为将小鼠宫颈鳞癌U14移植于KM、615近交系鼠建立动物模型,以研究嗜酸乳杆菌(L.acidophilus,LA)、干酪乳杆菌(L.casie,LC)对U14移植瘤的抗癌作用,并从诱导肿瘤细胞凋亡角度,初步探讨其抗癌机制,为应用生理性细菌——LB辅助治疗宫颈癌提供科学依据。移植瘤模型的建立瘤源:小鼠子宫颈鳞癌U14瘤细胞株,中国医学科学院肿瘤研究所提供,经常规复苏后,接种于615近交系小鼠腹腔传代。当小鼠腹水呈乳白色时,采集腹水并用PBS缓冲液稀释成5×107/ml瘤细胞悬液备用。菌种:LA标准菌株AS1.1878,LC标准菌株AS1.29,均由中国科学院微生物研究所菌种保藏中心提供,在微需氧环境中复苏培养于MRS培养基,以PBS稀释至5×1010/ml细菌悬液备用。实验动物:健康清洁级KM雌性小鼠44只,5～6周龄,体重25±2g,合格证号鲁动质字D20020921,由山东鲁抗医药集团动物中心提供;健康清洁级615近交系雌性小鼠24只,4～5周龄,体重20±2g,合格证号SCXK11-00-0005,由中国医学科学院肿瘤研究所提供。抗癌对照药物:DDP(Diaminodichloroplatin)注射针剂20mg/安瓿,山东齐鲁制药厂生产,批号0208013。KM小鼠移植瘤模型建立与分组:34只KM小鼠均于右侧背部皮下注射瘤细胞107个/只(0.2ml),随机分为4组,种瘤24h后腹腔注射,模型组注射PBS液0.2ml;LA组注射LA1010/只(0.2ml);LC组注射LC1010/只(0.2ml),均连续10d;DDP组(阳性对照组)注射DDP0.2mg/只(0.2ml)(即按DDP10mg/kg鼠体重,经折算相当人体用DDP量50mg/m2体表面积),为腹腔一次性注射后9d腹腔注射PBS液0.2ml。提前给予LA组的建立:10只KM鼠于第1天腹腔注射LA菌1010/只(0.2ml),连续5d,第6天建模型,24h后仍腹腔注射LA悬液(注射剂量、部位同前)10d。615小鼠移植瘤模型建立与分组:24只615小鼠建模后(注射剂量、部位同前),分3组(模型组、LA组、DDP组),余同KM鼠。取瘤与制备切片:所有小鼠停药(菌)2d后,颈椎脱臼处死,取瘤块,称重,常规10%中性福尔马林液固定,石蜡包埋,连续切片(约4μm厚),随机选1张HE染色,组织学确定为子宫颈未分化鳞癌,其它切片用于原位细胞凋亡检测。原位细胞凋亡检测:采用TdT(脱氧核苷酸转移酶)介导的dUTP缺口末端标记法——TUNEL法(试剂为美国CHEMICON公司产品)。组织切片常规脱蜡至水,0.3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性,0.1mg/ml蛋白酶K消化40min,TdT反应液、链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SP-HRP)37℃各作用1h,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,脱水、透明、封片。实验设加DNaseⅠ的为阳性对照,加不含TdT反应液的为阴性对照。普通光学显微镜随机选5个高倍视野(×400),记数其中凋亡细胞数,并算出凋亡细胞占肿瘤细胞总数的百分比值,即凋亡指数AI(apoptosisindex)。统计学方法:SAS6.12统计软件分析实验数据,数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析和组间s检验,两组间比较用t检验,P<0.05、P<0.01分别作为差异有显著性和极有显著性的标准。结果1.大鼠移植瘤模型中的肿瘤状况和动物死亡率各组小鼠皮下移植瘤细胞后,第5～7天出瘤,成瘤率100%。KM、615系鼠各死亡1只,均在DDP组。2.la对两种类型的老鼠移植瘤都有显著的抑瘤作用结果见表1。抑瘤率=(1-实验组平均瘤重÷对照组平均瘤重)×100%。3.首先，生殖器瘤的生长速度明显延迟。对照组结果见表2。4.la和lc对大鼠u14有显著的抗癌作用，la和lc之间没有显著的抗癌作用结果见表3。5.非凋亡细胞的细胞光镜下见,凋亡细胞明显固缩,核致密,深染为棕黄色多叶状或新月状颗粒,常集聚在核周边;非凋亡细胞的核呈蓝色(图1～3)。AI在615系模型组、LA、DDP组间的差异有极显著性(P<0.01,表4)。b对妊娠和肺癌作用的机制研究小鼠子宫颈鳞癌U14是应用专用线结经甲基胆蒽浸泡后,穿进幼鼠宫颈诱发成瘤后,移植于远交系KM小鼠皮下形成的一个异位子宫颈癌,能在小鼠(KM小鼠、615近交系小鼠)皮下形成可移植性实体瘤(成瘤率达100%),还可在腹腔内形成腹水瘤,有血道、淋巴道双向转移特性,因此建立U14动物模型是研究宫颈癌的理想模型。本实验中,KM小鼠及615近交系小鼠皮下移植U14瘤株后,其出瘤时间及瘤体生长情况与薛克勋等报道相似,移植瘤模型组瘤体平均重量大于1g,实验组瘤体平均重量大于400mg,说明U14移植肿瘤生长良好,本实验所建动物模型符合实验要求。乳酸杆菌(LB)作为生理性细菌,其抗癌作用及生物反应调节活性已倍受关注。研究证实,LB可明显抑制结肠癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌及恶性黑色素瘤等多种肿瘤的生长、转移和复发,LB可通过激活机体免疫系统,特别是巨噬细胞、NK细胞和B淋巴细胞,并使其分泌TNF-α、NO(nitricoxide)、INF-γ等效应因子而发挥抗癌作用。近期文献报道,LB的DNA含有大量非甲基化CpG二核苷酸为核心的重复序列,称为CpG基元(CpGmotif),具有较强的免疫调节活性。生殖道正常菌群中的LB主要是嗜酸乳杆菌(LA)等,由于阴道内LA数量的减少而造成的阴道菌群失调与细菌性阴道病、宫颈上皮瘤样病变(CIN)等癌前病变有关,推测LA与宫颈癌的发生、发展关系密切,而LA对宫颈癌抗癌作用的相关研究尚未见报道,因此,研究LA对宫颈癌的抗癌作用及其机制具有重要临床应用价值。在抗癌实验中,对实体瘤抑瘤率>30%～40%(统计学处理差异有显著性)为抗癌有效指标。本实验结果显示,LA对两种品系小鼠U14移植瘤的抑瘤率均超过40%,且提前给予LA的小鼠移植瘤生长速度显著慢于对照组,提示LA抗宫颈癌作用具有广泛性和有效性,并对于早期宫颈癌的发生或复发有一定抑制作用。实验同时研究了LC对宫颈癌的抗癌作用,其抑瘤率为50.68%。TUNEL法可原位检测凋亡细胞。细胞凋亡时,DNA会出现不对称的断裂点而形成缺口,末端转移酶(TdT)可将标记的dUTP结合在DNA缺口末端的3′-OH上,通过标记物显色系统在组织细胞原位检测凋亡细胞,并可在显微镜下计数凋亡细胞,较适于研究体内组织细胞凋亡,常应用于石蜡组织切片的细胞凋亡检测及定量研究,是检测细胞凋亡敏感性和特异性较高的实验。本实验结果LA实验组的AI为11.25%±4.06%,与模型组及阳性对照DDP组的差异有显著性,表明LA的抗癌机制中包括诱导肿瘤细胞凋亡,认为LA诱导巨噬细胞和NK细胞产生