近交系大鼠原位肝移植模型中cd8+cd28-细胞的生物学特点

近交系大鼠原位肝移植模型中cd8+cd28-细胞的生物学特点

近年来，一些科学家发现，从人体排出的cd8-cd28t细胞是一种特殊的t抑制细胞（称为cd8-t抑制细胞），这与不同免疫抗压（包括移植）的形成有关。我们的前期研究发现,近交系大鼠BN→LEW的原位肝移植后不需借助任何免疫抑制剂,即可形成自发免疫耐受,其具体机制尚不清楚,但可能与受体LEW大鼠脾脏CD8+CD28-T抑制细胞的含量增加有关(文章待发表),本研究探讨这种CD8+CD28-T抑制细胞在大鼠肝移植自发免疫耐受形成中的作用。细胞培养和皮肤移植实验动物:雄性Lewis(简称LEW,RT1l)和BrownNorway近交系大鼠(简称BN,RT1n),8～10周龄,体重200～250g。均购自VitalRiverInc,北京,饲养条件SPF级。正常供应饲料和饮水,手术前12h禁食。试剂:抗大鼠CD8b-RPE和抗CD28-FITC均购自Serotec(Oxford,UK),豚鼠血清购自GibcoBRL,大鼠CD8a-microbeads购自MiltenyiBiotech,小鼠IgG1抗大鼠CD28McAb(NA/LE)购自PharMingen,大鼠IL-2购自R&D。RPMI1640和胎牛血清(FBS)分别为GibcoBRL和Hyclone生产。3H-TdR,北京原子能研究所。大鼠原位肝移植模型的建立:参照Kamada的双袖套法,自发耐受组:BN(供体)→LEW(受体),4只,急性排异组:LEW(供体)→BN(受体),8只。脾脏淋巴细胞的提取:放血后迅速切取脾脏,将脾脏剪碎后过100目细胞筛(Falcon,BD),梯度离心法分离到脾脏淋巴细胞。流式细胞分析:向所提取的淋巴细胞(各106)中分别加入抗大鼠CD8b-RPE和抗CD28-FITC各10μl,4℃放置30min。加入抗体前后分别用含体积分数为1%的FBS的预冷PBS洗2遍。FACSCalibur计10000个细胞,利用CellQuest软件分析(BDBioscience,SanJose,CA)。同型对照:MousePE-IgG1,FITC-IgG1(Pharmingen,USA)。每份标本测定2次,取均值。CD8+CD28-T细胞的分离:利用抗体介导的补体细胞毒作用,即先用小鼠抗大鼠CD28McAb100μg标记脾脏单个核细胞108,再与补体(豚鼠血清)共同孵育,即会特异性杀伤CD28+细胞,剩下的细胞则为CD28-细胞。再利用MACSCD8a-microbeads分选出CD28-细胞中的CD8+T细胞,最后所得到的即为CD8+CD28-T细胞,其纯度大于95%,TCRαβ阳性率大于93%。混合淋巴细胞反应:自发耐受组LEW大鼠的淋巴细胞5×105与正常BN大鼠APC(脾脏单个核细胞过夜贴壁后获得,经丝裂霉素处理)1∶1共同孵育,并加入LEW大鼠的CD8+CD28-T细胞:0、1.25×105、2.5×105、5×105和5×105+IL-220U/ml。以正常LEW大鼠的淋巴细胞5×105与正常BN大鼠APC1∶1共同孵育作为对照。以上反应体系均为96孔板,终反应体积200μl,于37℃,5%CO2条件下孵育72h,终止反应前18h,每孔加入3H-TdR37kBq。培养结束后收集细胞,液闪计数仪(WALLC1410型,美国Pharmacia公司)检测cpm值。皮肤移植模型的建立:用钳夹法从供体和受体胸背部各剪下一块圆形全层皮肤,直径约2cm,将供体皮肤逆毛方向移植给受体,并用丝线缝合皮肤。用敷有青霉素的凡士林纱布包扎,并用胶布固定。术后第5天拆除包扎,每日观察和记录皮肤的存活情况,如果移植皮肤90%坏死,即判断为排异。细胞凋亡的检测:将淋巴细胞5×105与APC1∶1共同孵育,并加入CD8+CD28-T细胞5×105(对照组不加),终反应体积200μl,于37℃,5%CO2条件下共同孵育48h,收集细胞,利用annexinⅤ-FITCkit(BenderMedSystems公司)检测凋亡。RT-PCR:Trizol法提取CD8+CD28-T细胞总RNA,逆转录后,进行PCR扩增(PerkinElmerGeneAmpPCRsystem2400),参数为变性94℃30s、退火55℃45s、延伸72℃45s,共35个循环。1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶显色观察,各细胞因子的引物序列参见文献。统计学方法:方差分析和Kaplan-Meier生存分析,P<0.05则具有统计学意义。结果1.急性排异表现CD28-T细胞含量的变化:自发耐受组术后存活均超过100d,体重和肝脏组织学与正常大鼠无差异,急性排异组中位生存期9±5d,呈现典型的急性排异表现。急性排异组术后脾脏CD8+CD28-T细胞的含量无明显变化,自发耐受组大鼠脾脏CD8+CD28-T细胞的含量显著高于急性排异组和正常大鼠,CD8+CD28-T细胞占淋巴细胞的比例达30%,为急性排异组的4～6倍,而占CD8+T细胞的比例约为60%,为急性排异组的2～3倍(表1)。2.cd8+cd28-t细胞在lew大鼠肝脏组织中的诱导表达CD28-T细胞可抑制同种异体混合淋巴细胞反应:自发耐受组LEW大鼠对供体BN大鼠APC的增殖能力下降,仅为正常LEW大鼠的70%～80%左右,而急性排异组BN大鼠对供体APC的增殖能力与正常BN大鼠差异无显著性(图1A)。CD8+CD28-T细胞在自发耐受组LEW大鼠移植后明显增加,可能是介导抑制作用的主要细胞亚群。我们从自发耐受组LEW大鼠脾脏中分选得到高纯度的CD8+CD28-T细胞,按比例梯度加入到自发耐受组LEW大鼠淋巴细胞和供体APC的混合淋巴细胞反应体系中。结果显示,CD8+CD28-T细胞可以明显抑制同种异体混合淋巴细胞反应,并且为剂量依赖性,1∶1时抑制率达50%。而低浓度的IL-2(40U/ml)即可逆转CD8+CD28-T细胞介导的抑制作用(图1B)。急性排异组CD8+CD28-T细胞无抑制作用。3.皮肤长期生存稳定性异基因组大鼠(即BN→LEW,n=5)之间的皮肤移植物中位生存期(MST)为6±0.6d,而同基因组LEW大鼠(n=3)间的移植皮肤可获得长期存活(MST>60d,logrank值5.90,P=0.015,图2A)。若受体LEW大鼠移植前先接受60Co射线(6Gy)照射,则BN大鼠皮肤移植物的MST为10±0.8d(n=3);若受体LEW大鼠照射后再接受CD8+CD28-T抑制细胞(2×106/只)的输注,则BN大鼠皮肤移植物的MST显著延长,为15±1.8d(logrank值4.78,n=4,P=0.0288,图2B)。4.两组il-2和il-10mna的表达情况自发耐受组大鼠脾脏CD8+CD28-T细胞IFN-γmRNA明显高表达,同时也低表达IL-2和IL-10mRNA,而急性排异组仅弱表达IL-2和IL-10mRNA,几乎不表达IFN-γmRNA,两组CD8+CD28-T细胞均不表达IL-4mRNA。BN及LEW两种品系的大鼠在移植前以上各因子的表达差异无显著性(图3)。5.cd8+cd28-t细胞凋亡表达介导细胞凋亡是诱导免疫耐受的重要途径,但通过流式细胞技术检测annexinⅤ的表达后显示,CD8+CD28-T细胞并不增加混合淋巴细胞反应中的细胞凋亡数量(早期凋亡:3%vs2.5%;晚期凋亡:18%vs15%,P>0.05),而且自发耐受组和急性排异组之间差异无显著性。6.cd8+cd28-t细胞的增殖增殖大鼠脾脏CD8+CD28-T细胞在PHA50μg/ml、PMA/ion50/250ng/ml和IL-240U/ml等因子单独刺激下,无明显增殖;但在PHA50μg/ml+IL-240U/ml或PMA/ion50/250ng/ml+IL-240U/ml的联合刺激下,CD8+CD28-T细胞呈现有效增殖,尤其是后者(图4)。自发耐受组和急性排异组无差别。cd8+cd28-t细胞的抑制作用我们发现,自发耐受组大鼠脾脏CD8+CD28-T细胞含量显著高于急性排异组和正常对照组,体外可以抑制供体抗原介导的同种异体混合淋巴细胞反应的增殖,体内输注可延长皮肤移植物的存活,这就有力地证实肝移植自发耐受组中CD8+CD28-T细胞是一种特殊类型的T抑制细胞,其含量的升高可能是大鼠原位肝移植自发免疫耐受形成的机制之一。既往研究也表明,CD8+CD28-T细胞具有抑制功能,但通过何种机制发挥作用尚不清楚。本研究发现,外源性给予低浓度IL-2即可逆转大鼠脾脏CD8+CD28-T细胞的抑制功能,而且CD8+CD28-T细胞不会增加混合淋巴细胞反应体系中的细胞凋亡数量,提示CD8+CD28-T细胞可使同种异体T细胞发生无能,而不是发生凋亡,这也与其他学者的研究结果相吻合。有学者认为,CD8+CD28-T细胞的抑制作用有赖于与靶细胞的直接接触,而与所分泌的细胞因子无关;但Filaci等的研究结果与此相反,从SLE患者体内得到的CD8+CD28-T细胞的抑制作用与其分泌的IL-6和IFN-γ有关。本研究RT-PCR结果显示,自发耐受组CD8+CD28-T细胞IFN-γmRNA明显高表达,而急性排异组不表达。体内给予IFN-γ单抗并不能延长异基因皮肤移植物的存活,IFN-γ-/-的小鼠异基因心脏移植同样发生急性排异反应;利用CD28和CD40L单抗联合阻断共刺激信号可使小鼠异基因皮肤移植物获得长期耐受,但若同时给予IFN-γ单抗或IFN-γ基因敲除将导致急性排异。进一步研究发现,内源性IFN-γ可抑制混合淋巴细胞反应中TH的增殖和CTL效应,故IFN-γ在免疫耐受的形成过程中具有重要的调节作用,而并非如传统观点一样,认为IFN-γ是介导急性排异反应的重要因子。虽然急性排异组也可分离出足够量的CD8+CD28-T细胞,但不具有抑制功能,这就提示,除了数量的不同之外,自发耐受组和急性排异组之间CD8+CD28-T细胞的功能可能存在差异,而这种差异与具体表型的不同有关。最近有学者发现,具有抑制功能的CD8+CD28-T细胞表达CD27和perforin,而不具抑制功能的CD8+CD28-T细胞却很少表达这两种分子。perforin可以下调CD4+T细胞和CD8+T细胞对移植物的免疫反应,有利于免疫耐受的形成。但perforin是否也在大鼠CD8+CD28-T细胞中高表达尚需进一步研究证实。既往认为,CD8+CD28-T细胞是一种终末分化细胞,增殖能力有限,我们的研究结果表明,多种刺激因子单独应用均不能刺激CD8+CD28-T细胞增殖,包括PHA、PMA/ion和IL-2等,但若联合应用IL-2和丝裂原(PHA和PMA/ion),则可有效刺激其增殖,尤其是与PMA/ion和IL-2,增殖最为明显。这个发现具有重要的临床意义,我们有可