核酸的生物合成 完整版

核酸的生物合成第一节DNA的生物合成第二节RNA的生物合成第三节基因工程

遗传信息传递的中心法则DNARNA蛋白质复制复制转录反转录翻译?核酸的生物合成一、DNA的复制第一节DNA的生物合成

核酸的生物合成复制(replication)：以亲代双链DNA为模板，按照碱基互补配对的原则，合成出与亲代DNA相同的双链DNA分子的过程。DNA半保留复制的实验依据含N15-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液第二代

DNA生物合成时，亲代DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的新链。在子代DNA分子的两条链中，一条来自亲代，另一条是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念半保留复制的生物学意义生物的遗传信息通过DNA复制，亲代DNA的一条链保留在子代DNA分子中，新合成的链与亲代链碱基配对，从而使生物的遗传信息稳定地进行传递。DNA复制除了需要DNA模板，dNTP和Mg2+，还需要：DNA聚合酶Ⅰ、II、Ⅲ、Ⅳ、ⅤDNA解旋酶单链DNA结合蛋白(SSB）拓扑异构酶Ⅰ、Ⅱ引物酶DNA连接酶二、参与E.ColiDNA复制的酶类及相关因子第一节DNA的生物合成

核酸的生物合成（1）

DNA聚合酶Ⅰ多功能酶：①5

聚合酶活性对复制和修复中出现的空隙进行填补；②

5

外切酶活性对复制中的错误进行校对，保证复制准确性；③5

外切酶活性去除RNA引物和突变碱基。

主要功能是负责DNA的损伤修复。323aa小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow

片段605

aa5

DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端枯草杆菌蛋白酶DNA聚合酶Ⅰ928aa（2）DNA聚合酶II

•具有5

聚合酶活性和

5

外切酶活性，没有5

外切酶活性。

•只是在无polⅠ及polⅢ的情况下暂时起作用。

•对模板的特异性不高,参与DNA损伤的修复。（3）DNA聚合酶III催化E.ColiDNA复制的关键酶。由10种亚基组成不对称的聚合体。α，ε，θ亚基组成核心酶单体；α亚基具有5’→3’的聚合酶活性；ε亚基具有3’→5’外切酶活性和碱基选择功能；θ亚基可刺激ε亚基的外切酶活性。β亚基(DNA夹子)能夹稳模板链，负责将核心酶结合在DNA双链并沿DNA模板滑动。其余亚基统称为γ-复合物,促进全酶的组装及增强核心酶活性。DNA聚合酶Ⅲ5’→3’聚合活性3’→5’外切核心酶DNA夹子γ-复合物催化DNA聚合参与DNA损伤修复损伤修复切除引物功能2040400分子数/细胞－－+5

外切酶活性+++

5

外切酶活性+++5

聚合酶活性IIIIIIE.Coli中的DNA聚合酶E.Coli中的DNA聚合酶Ⅳ、Ⅴ主要参与DNA的修复。（4）真核生物的DNA聚合酶引物合成。复制的主要酶。参与DNA的修复。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。线粒体DNA复制。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

（5）引物酶(primase)依赖DNA的RNA聚合酶，。可以催化游离NTP聚合形成小片段RNA，。催化RNA引物的生成，对于DNA合成是必需的，在大肠杆菌，是dnaG基因的表达产物。引物（primer）：DNA聚合酶不能从头合成一条新的DNA链，而必须有一段RNA引物（十多个至数十个核苷酸不等），作为DNA复制的起始点，引物的3’-OH，必须是游离的。引物酶与经典的RNA聚合酶不同，对利福平不敏感。引物酶单独存在时相当稳定，只有在与有关蛋白质组成复合体时才有活性，该复合体称为引发体。（6）DNA连接酶（ligase）连接双链DNA中一条链上3

-OH末端和相邻碱基5

-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。HO5’3’3’5’DNA连接酶ATP（NAD+）AMP5’3’5’3’在复制中起接合双链中单链缺口的作用；在DNA修复、重组中也起缝合缺口作用；是基因工程的重要工具酶之一。DNA连接酶的功能（7）DNA解旋酶(helicase)

位于复制叉前，利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链，便于DNA聚合酶III和引物酶作用。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。解链方向解旋酶

（8）单链结合蛋白

(singlestrandbindingprotein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性（不被核酸酶降解）。SSB（9）DNA拓扑异构酶(topoisomerase)

（9）DNA拓扑异构酶(topoisomerase)

拓扑异构酶作用特点兼有内切酶活性和连接酶活性克服解链过程中的打结、缠绕现象。拓扑异构酶Ⅰ：每次通过断裂和连接双链DNA中的一条链而改变DNA的拓扑异构（超螺旋）。拓扑异构酶Ⅱ：每次通过断裂和连接两条DNA链而改变DNA的拓扑异构（超螺旋）。（一）复制的起始需要解决三个问题：复制起始位点的识别；

DNA解开成单链，提供模板；合成引物，提供3-OH末端。三、原核生物的DNA生物合成

DNA的复制可以分为3个阶段：起始、延伸和终止。DNA复制只能从DNA分子的特定区域内开始，此部位称复制起始点（originofreplication,ori）。DNA复制从起始点开始到终点结束，DNA上每个独立复制单位称为复制子。原核生物每个DNA分子只有一个复制起始点，因而只有一个复制子；真核生物的每个DNA分子有多个复制起始点，故含有多个复制子。大肠杆菌复制起始点oriC的结构245bp复制的起始过程DnaA蛋白与oriC的9核苷酸重复序列结合并打开13核苷酸保守序列形成单链DNA解旋酶(DnaB蛋白)被运送到复制模板，与模板结合解旋酶(DnaB)作用于氢键，消耗ATP，解开双螺旋变成单链单链DNA结合蛋白(SSB)与单链DNA结合，避免重新配对和降解引物酶（DnaG）催化合成最初的RNA引物DNA聚合酶III在RNA引物3’-OH端添加dNMP，合成新链3

5

3

5

引物3'HO5'引物酶DNA拓扑异构酶解旋酶SSB复制叉（二）复制的延伸复制的延伸指在DNA聚合酶III催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入到引物或新和成的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

前导链后随链复制过程简图顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这股链称为前导链(leadingstrand)。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为后随链(laggingstrand)。前导链连续复制而后随链不连续复制，就是复制的半不连续性。冈崎片段(Okazakifragment)：

•1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。冈崎片段再由DNA连接酶连成一条完整的新链。

•原核生物:1000-2000个核苷酸

•真核生物:100-200个核苷酸3

5

3

5

3´5´3´5´解链方向前导链(leadingstrand)后随链(laggingstrand)复制的半不连续性3´5´冈崎片段前导链后随链复制叉上的一个ＤＮＡ聚合酶分子如何实现两条链的同时合成？DNA聚合酶IDNA连接酶后随链上不连续性片段的连接1.去除RNA引物2.填补缺口3.连接切口5

5

335

5

OHP335

5

33（三）复制的终止(Termination)oriterTus定点起始（OriC），两个复制叉双向等速进行，Ter

终止，半保留、半不连续复制。（四）、原核生物复制的特点oriCTerDNA聚合酶能区分NTP与dNTP；DNA复制时按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本前提；DNA聚合酶具有3’-5’核酸外切酶活性和即时校对功能，可以检测并消除偶然出现的错误。RNA引物也是保证复制忠实性的因素。细胞内具有完整的DNA修复机制，可以校正、修复新合成DNA中的碱基错误及DNA损伤。（五）、DNA复制高保真性的酶学机制

DNA复制的出错率仅为10-10-10-9左右。复制的特点四、真核生物的DNA生物合成

半保留、半不连续复制；多起点复制，多复制子冈崎片段长度100－200nt；DNA复制的同时，组装成新的核小体。oriorioriorioriori五、反转录以RNA为模板合成DNA的过程称为反转录(reversetranscription),催化这一反应的酶称为反转录酶。反转录酶也需要引物。依赖RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H依赖DNA的DNA聚合酶六、DNA的损伤、修复与突变（一）DNA损伤(DNAdamage)：

泛指一切DNA结构和功能的变化。包括各种突变、碱基的损伤和DNA链的断裂。引发DNA损伤的因素自发性:自然错配率约为10-9～10-10

左右。物理因素:如UV、各种辐射。化学因素:烷化剂、碱基类似物、以及其他一些人工合成或环境中存在的化学物质，这些诱发突变的化学物质,称为致癌剂。生物因素:抗菌素类、黄曲霉素和病毒等。紫外照射时DNA链中相邻嘧啶形成二聚体。（二）DNA突变DNA分子中碱基序列改变，从而导致DNA的复制及后来的转录和翻译随之发生变化。DNA突变分为自发突变和诱发突变。突变类型：1.置换：一个或几个碱基的替换，又称点突变。

转换：Py被Py替换或者Pu被Pu替换；颠换：Py被Pu替换或者Pu被Py替换。2.

插入：DNA链中插入一个或几个碱基；3.缺失：DNA链中缺失一个或几个碱基。转换插入缺失野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-颠换

-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-AT（三）修复1.光裂合酶修复：经光照射后，光裂合酶修复嘧啶二聚体。2.切除修复：主要修复机制，在一系列酶作用下切除受损伤部分，以完整的一条链为模板，合成出切去的部分，使DNA恢复正常结构。3.重组修复：受损伤部位DNA复制后留下缺口，在重组酶的作用下，带缺口的DNA与完整的姐妹染色单体的双链DNA进行重组交换。切除修复动画一、转录(transcription)：

以单链DNA为模板，NTP为原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA的过程。

第二节RNA的生物合成

核酸的生物合成转录仅以DNA一条链的某一区段为模板，这种转录方式称为不对称转录。二、转录模板：

双链DNA分子中作为模板转录出RNA的那条链，称为模板链（反义链，负链）；另一条链称为编码链（有义链、正链）。三、RNA聚合酶：

核心酶全酶

起始因子，带领核心酶识别启动子与DNA模板结合聚合酶活性结合启动子及聚合酶其余组分原核生物只有一种RNA聚合酶。四、转录过程：

转录过程分为起始、延伸和终止三个阶段：

1.起始：基因上由RNA聚合酶识别、结合并确定转录起始位点的特殊DNA序列称为启动子。-15’3’AATTGCCTGACGTTT***********GACCGT+1编码链5’3’TTAACGGACTGCAAA***********CTGGCA模板链ACGUUU***********GACCGU-10区富含AT，又称为TATAbox或Pribnowbox，有助于DNA双螺旋的局部解链；-35区与转录起始的辨认有关，并决定启动子的强度。①

RNA聚合酶全酶识别-35区，并与启动子结合；②

在σ亚基作用下从-10区开始解链，在DNA链上形成转录泡；③

加入第一个NTP启动RNA合成。RNA的合成不需要引物。转录起始过程：2.延伸：形成启动子-全酶-NTP三元复合物后，新的NTP加入，形成磷酸二脂键。聚合几个核苷酸后，σ亚基从全酶上解离。核心酶沿模板链3’→5’的方向移动，按照碱基配对的原则以5’→3’方向合成RNA链。E.ColiRNA聚合酶以45个核苷酸/秒的速度合成RNA。RNA聚合酶缺乏核酸外切酶活性，不具备校对功能。

3.终止：基因末端终止转录的一段特殊DNA序列称为终止子。不依赖ρ-因子的终止子

特点：在转录终点前有一段富含G-C的回文序列，其下游有6—8个T。终止子序列被转录后回文序列形成发夹结构，使聚合酶减慢或暂停RNA合成。发夹结构之后转录出一系列U，RNA-DNA杂交链中的U-A碱基配对结构不稳定，极易被破坏，导致RNA-DNA杂交链在终止区解链，RNA聚合酶脱离模板，使转录终止。依赖ρ-因子的终止子特点：含回文序列，转录后也形成发夹结构，但其中G-C序列少，发夹结构后也缺乏一系列的U，需要ρ因子的帮助才能终止RNA的合成。聚合酶在终止子暂停，ρ因子借助水解ATP供能，追上聚合酶并利用解旋酶活性使RNA-DNA解链，转录停止。ρ因子六个亚基组成的蛋白质；具有ATP酶活性；具有DNA-RNA解旋酶活性。五、RNA转录加工：

原核生物mRNA可直接作为翻译的模板，一般不进行转录后加工；而rRNA、tRNA原初转录产物均为无功能的前体，必须经过加工、修饰才能成为有功能的分子。转录后加工包括切除某些核苷酸序列、拼接、形成5’和3’端的特殊结构、碱基修饰、改变糖苷键等过程。1、原核生物中rRNA前体的加工2、tRNA前体分子的加工E.Coli

有60种tRNA,少数随rRNA

一起转录，其余成簇排列，转录成含有两个或多个tRNA的前体。其加工过程包括：切除tRNA前体两端多余的序列；

3’端添加CCA；对碱基进行特殊修饰。酵母酪氨酸tRNA前体的加工加工六、真核生物中的转录：

1、转录与翻译场所不同真核生物的转录比原核生物复杂，主要特征：原核生物中mRNA的转录与翻译几乎同时进行，而真核生物转录发生在细胞核内，翻译发生在细胞质中。2、RNA聚合酶不同原核生物只有一种RNA聚合酶，而真核生物至少有三种RNA聚合酶。Ⅰ:rRNA(5.8S,18S,28S)；Ⅱ:mRNA,microRNA，对α-鹅膏蕈碱高度敏感；Ⅲ:tRNA,5sRNA；

Ⅳ:siRNA(植物中)。类鬼笔鹅膏3、启动子不同真核生物中不同RNA聚合酶分别有自己的启动子。许多RNA聚合酶Ⅱ识别的启动子在-25区有TATAbox。另外，真核生物启动子序列含有许多种类、数量和位置不同的核酸保守序列（顺式作用元件，cis-element），决定了基因的表达特征。4、转录后RNA加工修饰不同真核生物rRNA及tRNA的转录加工与原核生物类似。真核生物mRNA以单个基因为转录单位，转录成单顺反子mRNA。多数基因是不连续的，编码序列（外显子，extron）被非编码序列（内含子，intron）分割成若干片段，称为断裂基因。UTR，untranslatedregion，非翻译区编码序列（外显子）非编码序列（内含子）5’3’外显子和内含子一起被转录生成mRNA前体分子，在核内加工形成大小不等的中间物，称为核不均一RNA(hnRNA，heterogeneousnuclearRNA)。hnRNA的加工：1.转录完成之前在5’端加帽子结构(m7G5’ppp5’Np---)；2.在3’末端添加多聚腺苷酸（polyA，150-250）尾巴；3.剪去内含子，拼接外显子；4.链内特定核苷酸的甲基化（m6A）。

UTR，untranslatedregion，非翻译区编码序列（外显子）非编码序列（内含子）CAPAAAAAAAAACAPAAAAAAAAA成熟的mRNA1.核苷酸合成抑制剂核苷酸合成代谢底物或中间产物的结构类似物。

氨基酸类似物：Gln－重氮乙酰丝氨酸等；

叶酸类似物：FH4－氨基蝶呤等；

碱基和核苷类似物：6－巯基嘌呤等。七、核酸合成抑制剂：2.与DNA模板结合的抑制剂与DNA结合，使DNA失去模板功能，抑制复制及转录。（1）嵌合剂：放线菌素D、溴化乙锭等。（2）烷化剂：氮芥(C5H11Cl2N)；硫芥(C4H8Cl2S)。芥子气毒气弹2.作用于聚合酶的抑制剂此类抑制剂直接作用于DNA聚合酶或RNA聚合酶。如：利福平（结合RNA聚合酶β亚基，阻断转录启动）；

曲张霉素（阻断RNA链延伸）；

膦羧基乙酸（抑制DNA