第八章 基因重组蛋白包涵体的复性

第八章

基因重组蛋白包涵体的分离和复性

北京化工大学谭天伟教授重组蛋白的复性概述包涵体的形成包涵体的分离纯化蛋白质复性方法基因重组蛋白包涵体的分离和复性

包涵体的分离和蛋白质复性随着基因工程技术的迅猛发展，人们可以在外来宿主细胞中控制目的蛋白质的生产，从而为临床和工业生产提供一些因自然原料缺乏而无法大量获得的蛋白质多肽产品。迄今为止，人们已经成功地实现了用多种原核、真核表达系统生产基因工程蛋白基因工程表达产物后处理的特殊性8.1重组蛋白质

大肠杆菌的重组菌

有多种可选择的质粒；重组遗传背景清楚，基因表达易于控制；蛋白表达量高（可达总蛋白50％）；

酵母

易于糖基化和正确形成二硫键；表达产物分泌至胞外，易分离纯化；易于大规模培养和生产

动物细胞

产物分泌至培养液，易分离纯化；重组蛋白活性和天然蛋白一样；表达质粒易于得到；重组细胞可以大规模培养补充：蛋白质在E.coli中的表达E.coli表达系统优点：操作方便遗传背景清楚廉价培养基中迅速生长→发酵成本低、周期短目的蛋白可获高水平表达→E.coli是生产重组蛋白的首选表达系统，特别是对那些不需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有生物活性的基因工程蛋白51％8.2包涵体的形成在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包涵体。包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。

包涵体形成的几种可能性研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成包涵体。1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在细胞内溶解度时沉淀；2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对；3）蛋白产生量过多，所需其他成分(如折叠酶和一系列翻译后修饰酶及分子伴侣等)不足；4）重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多、Pro含量越高越容易形成包涵体。5）重组蛋白所处的环境：发酵温度高时容易形成包涵体。6）有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。减少包涵体形成的策略1）降低重组菌的生长温度：较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。2）添加可促进重组蛋白质可溶性表达的添加剂，如：培养E.coli时添加乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）等。3）供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。包涵体形成：有利因素1、包涵体形式表达的蛋白质浓度比较高，有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的40%2、重组蛋白质以包涵体形式存在→包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击3、分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离4、有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而包涵体形式的蛋白质因丧失了生物活性→高效地表达包涵体加工流程离心去除细胞碎片（膜蛋白和脂类等）机械破碎法包涵体提取如何对包涵体蛋白进行高效体外复性以获得活性产品是生物工程产业化经常面临的一个难题8.3包涵体的提取、溶解与纯化8.3包涵体的提取、溶解与纯化①包涵体的提取

细胞破碎，包涵体的分离②包涵体的洗涤

对包涵体用Tris-HCl缓冲液反复洗涤几次缓冲液通常含有Triton-X100、脱氧胆酸盐、尿素、PMSF等对包涵体中含的杂蛋白的洗涤最高可采用5M的尿素

③包涵体的溶解

如5-6M的盐酸胍或6-8M的尿素，同时还要加入还原剂，打开错配的二硫键，如二硫苏糖醇（DTT）、2-巯基乙醇、DET或半胱氨酸等，pH一般维持在8左右④包涵体的纯化

包涵体溶解后可以通过膜过滤、RPLC、RP-HPLC、凝胶过滤、离子交换层析或金属亲和层析等方法实现表达蛋白洗涤剂pH人干扰素－3突变体（hIL-3）7M尿素,0.5％TritonX-100未报道人尿激酶原（Pro-Uk）05MPBS,2%TritonX-1007.5HIV-1Gagp24蛋白1％Triton100X-100未报道大鼠釉原蛋白（Am）50mMTris-Cl,10mMEDTA100mMNaCl,0.5％TritonX-1008.0抗人结肠癌单链抗体（CL-3）1mg/mlDOC,50mMTE1%TritonX-100未报道人FLT3配体3M尿素,0.1MTris-Cl8.0重组干扰素（IFN-γ）50mMTris-Cl,100mMNaCl,0.5mMEDTA3M尿素,0.2%TritonX-1008.0人睫状神经营养因子（CNTF）STE,2M尿素,0.05％TritonX-1008.0人尿激酶原（Pro-Uk）50mMTris-Cl,5M尿素0.5％TritonX-1007.5血管内皮细胞生长因子（VEGF165）2MNaCl,0.5％TritonX-1004M尿素未报道包涵体形成的机制：

U←→I←→NU：指完全去折叠的状态，I：指折叠中间体（也称融球态moltenglobulestate）N：指天然的成熟的状态8.4重组蛋白的体外复性蛋白质复性机理蛋白质复性过程中，涉及两种疏水相互作用：一是分子内的疏水相互作用→促使蛋白质正确折叠二是肽链分子间的疏水相互作用→导致蛋白质分子间聚集，形成寡聚体和多聚体→再进一步聚集形成沉淀→两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。→复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提高复性收率的关键。伸展态U中间体I局部肽段先由氢键形成一些二级结构构象单元，如α螺旋、β折叠、β转角等聚集体A天然态N快慢影响复性效率的因素1）蛋白质本身的性质有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11；一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率在20%左右影响复性效率的因素2）蛋白质的复性浓度I向N的转化是一级反应，而聚沉是二级或多级反应聚沉的反应速度与蛋白质浓度的平方或高次方成正比而复性反应过程与蛋白质浓度的一次方成正比，故浓度越大，聚沉反应越明显。→复性时蛋白质浓度宜低（低浓度时，获得的蛋白质复性效率比高浓度要好的多）另一方面浓度过低又给后处理带来不便，一般选择10－100μg／ml，以避免分子间相互作用力引起聚集。影响复性效率的因素3）变性剂浓度和复性时间在高浓度变性剂存在时，蛋白质主要以U存在（6mol/L盐酸胍、8mol/LUrea等）；在中间浓度时（较低浓度的盐酸胍和Urea），主要以I存在，即能抑制蛋白质分子间的疏水相互作用，又不会妨碍蛋白质分子内疏水相互作用→A方向被阻止。由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长的一段时间，I就可以慢慢地向N转化影响复性效率的因素4）氧化还原环境复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形成S-S的环境→合适的氧化还原环境采用配对的氧化型和还原型巯基物质配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基乙醇/胱氨酸等。通常还原型巯基物质的使用浓度为l~3mmol/L，还原型/氧化型的摩尔比为10：1或5：1。影响复性效率的因素5）pH和温度最适宜的复性pH值应大于7.0（一般8.0-9.0），以防止自由SH-的质子化作用影响正确配对的S-S的形成。

应避免在蛋白质pI处进行复性（蛋白质的静电排斥力几乎为零，相互间疏水作用区域就容易作用而形成A）。温度过高，蛋白质的聚集将十分严重，低温下聚集和折叠反应都很慢，随着温度的上升二者的速度都加快→常在室温下进行影响复性效率的因素6）折叠促进剂

能够促进蛋白再折叠的化学物质统称为折叠促进剂，折叠促进剂的作用原理在于稳定复性蛋白质的天然结构、抑制肽链间的疏水相互作用。应用于蛋白质复性并具有显著效果的折叠促进剂有表面活性剂、聚乙二醇PFG、L－精氨酸、抗体、分子伴侣等。

包涵体的分离和蛋白质的复性由于蛋白质的多样性、结构和折叠过程的复杂性，使得人们不能对一种复性方法进行简单的移植，也很难找到具有普适性而又低成本的高效复性方法。实际操作过程中必须针对每种目标蛋白的特点对影响复性的各个因素逐一优化才能最终确定适用于该种蛋白质的复性方法一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率在20%左右重组蛋白再折叠的方法稀释法抗体协助的再折叠分子伴侣介导的再折叠反向微团利用双水相体系进行再折叠色