抗菌药物敏感性试验流程

天长天康医院检验科工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本:1.0页码：第1页共26页编写者：熊静静审核者：夏清批准人：胡军生效日期：2020.8.10文件发放范围：微生物组文件年度审核审核者：审核者：审核者：审核者：日期：日期：日期：日期：抗菌药物敏感性试验流程目的：抗菌药物敏感性试验（药敏试验）的主要目的是检出细菌的耐药性，预测抗菌药物的临床治疗效果，并为临床医生针对某一特定的临床感染问题选用药物提供依据。适用范围微生物实验室所有标本，环境。职责范围微生物实验室各工作人员。药敏试验的一般规则4.1对任何感染的可疑病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。如果感染是由公认的对某一高效药物敏感的微生物引起，常规不需要进行药敏试验，见附录6［技术说明（1）］。4.2同一患者连续分离培养出的同一种细菌，若最初药敏试验显示为敏感株，随后临床出现可疑的耐药表现，需重复进行药敏试验，见附录6［技术说明（2）］。4.3进行细菌耐药性调查和抗生素疗效评估时需进行药敏试验。4.4除临床急症细菌学检查标本，并经直接涂片染色证实为单一致病菌外，一般不主张用临床标本直接做药敏试验。直接标本做药敏试验后，必须按标准方法重做一次。4.5当感染的性质不清楚、标本内含数种混合生长的细菌或正常菌群，而且这些细菌与感染的关系很小时，通常不必做药敏试验。常规药敏试验药物选择原则5.1选择适合的药物进行药敏试验一般应由临床微生物检验医师与感染科医师、药剂科、医院药事委员会和医院感染委员会成员共同协商作出决定。在选择抗菌药物时应考虑以下因素：工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第2页共26页5.1.1一般情况下，药敏试验所选用的抗菌药物应包含于本单位的处方手册中。5.1.2临床微生物实验室所服务的医疗机构的类型、规模及患者的构成不同，其所分离细菌的耐药谱不同，药敏试验的药物选择不同。5.1.3菌种类型不同，药敏试验的药物选择不同。5.2我国目前主要依照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）/临床实验室标准化研究所（CLSI）所制定的药敏试验执行标准作为选药指南（见附录1〜2）。该指南针对每一菌群所推荐的药物都具有确切的临床疗效，其体外试验结果也可以接受。在附录1〜2表内小格中的列出个小框中列出的一群类似药物，由于它们的解释结果和临床效力都很相似，因此不必每个都进行试验。另外，用“或”字表示的一群相关的药物，其抗菌谱和结果解释几乎完全相同，其交叉耐药性和交叉敏感性也几乎完全相同。因此，通常每个小框（组或相关的群）中只选择一种药物进行试验。5.3NCCLS文件每年都有补充和更新，为了保证药敏试验的正确性和对临床的指导性，进行药敏试验时应依照最新版本（本规范中提供的是2005年修订的第十五版）。药敏试验方法6.1纸片扩散法6.1.1抗菌药物纸片：一般应购买合格的商品化的药敏纸片进行试验，药敏纸片的贮存见附录6［技术说明（3）］。6.1.2琼脂培养基非苛养菌的常规药敏试验使用MH（Mueller-Hinton）琼脂，其制备、贮存和使用方法见附录6［技术说明（4）］。6.1.3菌悬液的浊度标准使用0.5麦氏（McFarland）标准管，见附录6［技术说明（5）］。6.1.4纸片扩散法的操作6.1.4.1接种物的制备6.1.4.1.1生长法：从琼脂平板上选取至少3〜5个形态特征一致的菌落，用接种环接触每个菌落顶部后将细菌转移到含4〜5ml适宜的肉汤培养管（如胰酶消化大豆肉汤）中，将此肉汤培养物置35°C孵育至其浊度等于或超过0.5麦氏标准（通常需2〜6小时）。用无菌盐水或肉汤将旺盛生长的肉汤培养基的浊度调整到相当于0.5麦氏标准，细菌数约为1〜2X108CFU/ml。工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第3页共26页6.1.4.1.2直接菌悬液法：从孵育18〜24h的非选择性培养基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用肉汤或盐水制成悬液作为接种物，然后将浊度调整至0.5麦氏标准。此法是检测苛养菌（如嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌和链球菌）和潜在的对甲氧西林耐药的葡萄球菌的推荐方法，见附录6［技术说明（6）］。6.1.4.2接种应在菌悬液制备后15分钟内接种MH琼脂平板。用无菌棉拭蘸取菌液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度以确保接种菌的均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。6.1.4.3贴药敏纸片接种好的平板可敞开盖子倒置在室温下干燥3〜5min，在15min之内用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完全接触。各纸片中心相距应大于24mm，通常直径150mm平板至多贴12个纸片，直径90〜100mm平板至多贴6-7个纸片。某些药物在纸片贴于琼脂平板后几乎立即扩散，一旦纸片贴上后就不能再移动，若要重新放置，可用一个新的纸片贴在平板的另一位置。6.1.4.4孵育：纸片贴好后，15min内将平板倒置放入35°C孵箱（苛养菌药敏平板应放置于5%CO2环境中）16〜18h后读取结果，见附录6［技术说明（7）］。葡萄球菌和肠球菌必须孵育整24h以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。6.1.4.5结果判读：抑菌圈呈透明圆环状，菌苔生长的平面应该是均匀连续的，如出现明显的单个菌落生长说明接种菌的浓度太低，应重新进行试验。抑菌圈的直径（包含纸片的直径），以毫米数报告（取整数），见附录6［技术说明（8）］。对某些细菌抑菌圈的判读有特殊要求6.1.4.5.1检测苯唑西林和万古霉素对葡萄球菌或肠球菌的抑菌圈需要用透射光（将平板对着光线）。抑菌圈的边缘应不见细菌的明显生长，若只有用放大镜才可发现的微弱生长的细小菌落则可以忽略。）检测葡萄球菌或肠球菌时，在苯唑西林纸片（葡萄球菌）或万古霉素纸片（肠球菌）周围的抑菌圈内有任何可辨的菌落或生长薄膜（包括针尖样菌落）则提示耐药。6.1.4.5.2对其他细菌，若在清楚的抑菌圈内有独立的菌落生长，则提示可能接种的菌种不工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第4页共26页纯，需要重新分离、鉴定和药敏试验，但此菌落也可能为抗菌药物选择出的高频突变耐药株。6.1.4.5.3变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物的抑菌圈内，所以在明显的抑菌圈内有薄膜样爬行生长可以忽略。6.1.4.5.4对于链球菌应检测生长抑制圈而不是溶血抑制圈。对于甲氧苄啶和磺胺，拮抗物可使细菌轻微生长（生长菌苔的20%或以下），所以抑菌圈直径的检测应不考虑细微生长的部分而测量比较明显的边缘。纸片扩散法操作流程及某些特殊细菌的药敏试验要求见附录4、5。6.2稀释法：稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。试验时抗菌药物的浓度通常经过倍比（log2）系列稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度称为最小抑菌浓度（MIC）。一个特定抗菌药物的测试浓度范围应包含能够检测细菌的解释性折点（敏感、中介和耐药）的浓度，同时也应包含质控参考菌株的MIC。稀释法是标准药敏试验的参考方法，但因操作烦琐，不易在常规工作中开展，常用于临床药理研究和方法学的评价。在稀释法中一般常使用微量稀释法（可与自动微生物分析仪配套使用），其方法如下：6.2.1肉汤稀释（常量）法6.2.1.1使用无菌的13X100mm试管，每一浓度抗菌药物的量至少为1ml，通常为2ml。6.2.1.2推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%NaCl（w/v），MH肉汤按制造厂家的要求制备。6.2.1.3抗菌药物的制备、贮存和稀释：药物来源用使用抗菌药物标准品或参考药粉，而不应该使用胃肠道用的制品，对所用的抗菌药物都应分析其标准活力单位，称取药物时应使用校正过的分析天平，用准确称取的抗菌药物配制母液，母液浓度至少应为1000g/ml，或者是最高测试浓度的10倍，少量的母液可分装于无菌的小瓶中，仔细密封后贮存于-60°C或更低，小瓶可以按需要融化并在当天使用，药物的稀释见附录6［技术说明（9）］。为减少抗菌药物的蒸发和变质，试管应盖紧并于4C〜8C保存，稀释好的抗菌药物溶液应在5天内使用。6.2.1.4接种物的准备和接种6.2.1.4.1汤稀释法推荐的接种物最终接种浓度为5X1053FU/mL。首先通过生长法或直接菌工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第5页共26页落悬液法制成浊度为0.5McFarland标准的菌液，用肉汤将上述菌液进行1：100稀释（106CFU/ml）,分别取1mL接种物，加入装有1mL抗菌药物肉汤稀释液的各支试管和一支不含抗菌药物的生长质控管中，并将每个试管混匀，这样每个抗菌药物浓度都被1：2稀释，菌液浓度为5X105CFU/ml。见附录6［技术说明（10）］。6.2.1.4.2按规定配制的菌液应在15分钟内接种，并取一份接种菌液在非选择琼脂平皿上传代培养，以检查接种物的纯度。6.2.1.5孵育：接种好的常量稀释管应放在35°C普通空气孵箱中孵育16〜20h，当测试嗜血杆菌和淋病奈瑟菌时，应在5%的CO2中孵育20〜24小时，对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素的肠球菌孵育应持续整24小时。6.2.1.6结果判读在读取和报告所测菌株的MIC前，应检测生长质控管或孔（不含抗菌药物）的细菌生长情况，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否被污染及接种量是否合适，质控菌株的MIC值应处于合适的质控范围。生长终点的判读可通过含有抗菌药物的管与生长质控管的比较来进行，通常细菌的生长可通过可见的浊度、一个直径灵mm的沉淀菌斑或多个小菌斑来显示，能抑制细菌生长的最低抗菌药物浓度为该抗菌药物对被测菌的MIC。见附录6［技术说明（11）］。6.2.2肉汤稀释（微量）法：操作方法同常量法。多用商品试剂并与自动仪器配套，详见供应商的产品说明书。自制的含药微量稀释盘应用塑料袋密封包装并立即置于W-20C（最好W-60C）保存至需要时，在-20C大多数抗菌药物可保存至少6周，但某些不稳定的抗菌药物除外，如亚胺培南、头孢克洛、克拉维酸等。解冻的抗菌药物溶液不能重新冷冻，因反复冻融会加速某些抗菌药物，特别是B-内酰胺类的降解。几种重要耐药菌的监测7.1肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌中ESBLs检测的筛选与确证试验

工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第6页共26页~I 件编: Hc工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第6页共26页工作流程 T5T5CE 版本：L0 页码：第6贝共26贝表1肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌中ESBLs检测的筛选与确证试验方法初步筛选试验表型确证试验培养基Mueller-Hinton琼脂Mueller-Hinton琼脂抗菌药物纸片浓度头孢泊肟10^g或头孢他啶30ng或氨曲南30ng或头孢噻肟30ng或头孢曲松30ng（使用一种以上的药物进行筛选将会提高检测的敏感性）头孢他啶30ng头孢他啶/克拉维酸30/10ng和头孢噻肟30ng头孢噻肟/克拉维酸30/10ng（确证试验需要同时使用头孢噻肟和头孢他啶，单独和联合克拉维酸的复合制剂）接种按标准纸片扩散法的规定进行按标准纸片扩散法的规定进行孵育条件孵育时间判读结果头孢泊肟的抑菌圈W17mm头孢他啶的抑菌圈W22mm氨曲南的抑菌圈W27mm头孢噻肟的抑菌圈W27mm头孢曲松的抑菌圈W25mm提示可能产生ESBLs2个药物中有任何一个，在加克拉维酸后，抑菌圈直径与不加克拉维酸的抑菌圈相比，增大值N5mm时，判定为产ESBLs（如，头孢他啶的抑菌圈为16mm；头孢他啶/克拉维酸的抑菌圈为21mm）

工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本:1.0页码：第7页共26页7.2纸片扩散法预测葡萄球菌中mecA介导的耐药性表2纸片扩散法预测葡萄球菌中mecA介导的耐药性抗菌药物（药物含量）细菌分类抑菌圈直径（皿）解释头孢西丁（30共）金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌W21N22抑菌圈W19mm应报告对苯唑西林耐药，N20mm应报告对苯唑西林敏感除路邓葡萄球菌外的血浆凝固酶阴性葡萄球菌W24N25抑菌圈W24mm应报告对苯唑西林耐药，N25mm应报告对苯唑西林敏感7.3高水平氨基糖苷类耐药肠球菌（HLAR）、万古霉素耐药肠球菌（VRE）、万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（VRSA）的筛选表3HLAR、VRE、VRSA的筛选筛选试验庆大霉素HLAR链霉素HLAR万古霉素耐药培养基脑心浸液肉汤或琼脂脑心浸液肉汤或琼脂脑心浸液琼脂抗菌药物浓度500^g/ml肉汤：1000^g/ml琼脂：2000|ig/ml6^g/ml接种生长法或直接菌悬液法制备0.5麦氏管菌悬液琼脂：取10^菌悬液点种于琼脂表面肉汤：按标准稀释法操作生长法或直接菌悬液法制备0.5麦氏管菌悬液琼脂：取10|!菌悬液点种于琼脂表面肉汤：按标准稀释法操作生长法或直接菌悬液法制备0.5麦氏管菌悬液琼脂：取10|!菌悬液点种于琼脂表面孵育条件35°C，空气35C，空气35C，空气培养时间24h24〜48h（如果24h结果为敏感，再孵育24h）24h结果琼脂：＞1个菌落生长为耐药肉汤：生长为耐药耐药：表示与作用于细胞壁的抗生素（如阿莫西林、青霉素、万古霉素）无协同作用敏感：表示与作用于细胞壁的抗生素（如阿莫西琼脂：＞1个菌落生长为耐药肉汤：生长为耐药耐药：表示与作用于细胞壁的抗生素（如阿莫西林、青霉素、万古霉素）无协同作用敏感：表示与作用于细胞壁的抗生素（如阿莫西＞1个菌落生长可推测为耐药阳性菌株应检测万古霉素的MIC，根据附录3结果判断其敏感性

林、青霉素、万古霉素）有协同作用林、青霉素、万古霉素）有协同作用质控粪肠球菌ATCC29219敏感粪肠球菌AT2251299耐药粪肠球菌ATCC29219敏感粪肠球菌AT2251299耐药粪肠球菌ATCC29219敏感粪肠球菌AT2251299耐药~I 件编: HY—X.^、c ，，，'、， Qlf|*II.ccI>I*工作流程 T5T5CE 版本：L0 页码：第8贝共26贝8.药敏试验结果的报告工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第8页共26页敏感（S）：表明使用所测试药物的日常成人剂量在体内达到的浓度能够有效地杀死或抑制细菌生长。中介（I）：包括一些菌株，其抗菌药物MIC接近于血液和组织中通常可达到的水平，而抗菌药治疗的反应率可能低于敏感株。“中介”意味着药物在生理浓集的部位具有临床效力（如尿液中的喹诺酮类和B-内酰胺类）或者可用高于正常剂量的药物进行治疗时也可有临床疗效（如B-内酰胺类）。此分类还包括一个缓冲区，它可以避免微小的、未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误，特别是对那些药物毒性范围窄的药物。对某些重要药物的中介结果应通过定量报告（MIC值）进一步明确区分为敏感或耐药。耐药（R）：表示使用所测试药物的最大剂量在体内达到的浓度仍不能杀死或抑制细菌生长。注意：如果解释标准中仅给出“S”的标准，那是由于对于某些细菌/抗菌药组合，尚不存在耐药菌株，因此除了“敏感”以外没有标明任何其他分类。如果菌株的试验结果提示“不敏感”，应证实细菌鉴定和药敏试验结果，随后将此菌株保藏和递交到参考实验室用NCCLS参考稀释法证实其结果。8.2推测性药敏结果报告：一般情况下，报告的药物必须是试验过的，但如果另一种药物的试验可提供对该药更为准确的结果则可以例外，通常所试药物应与医院处方手册中的药物相匹配，或者在报告时指明哪些未试药物与所试药物有相似的解释结果。药敏试验中常用的试验药物及其代表的药物见表4

工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第9页共26页表4药敏试验中常用的试验药物及其代表的药物试验药物菌种试验药物菌种苯唑西林耐药葡萄球菌属四环素敏感所有菌属红霉素敏感和耐药链球菌属氨苄西林敏感和耐药肠球菌属氨苄西林敏感粪肠球菌葡萄球菌属、淋病奈瑟青霉素敏感菌青霉素敏感和耐药肠球菌头孢噻吩敏感和耐药肠杆菌科氨苄西林敏感和耐药所有菌属磺胺异恶唑敏感和耐药所有菌属萘啶酸耐药肠杆菌科头孢噻吩/头孢唑林敏感肠杆菌科青霉素敏感链球菌可被推测的抗菌药物结果所有B-内酰胺类，包括酶抑制剂复合药和碳

青霉烯类均耐药对多西环素、米诺环素敏感罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、地红霉素

敏感和耐药不产B-内酰胺酶的肠球菌对阿莫西林、哌拉

西林及其与酶抑制剂的复合剂敏感和耐药

亚胺培南敏感所有青霉素类、B-内酰胺酶抑制剂复合物、头孢类、碳青霉烯类敏感不产B-内酰胺酶的肠球菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦的敏感和耐药头孢匹林、头孢拉啶、头孢氨苄、头孢克罗、头孢羟氨苄敏感和耐药阿莫西林、巴氨西林、氨环己西林、海他西

林敏感耐药所有磺胺类敏感和耐药

所有喹诺酮类耐药所有头孢菌素敏感氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、头孢克洛、头孢唑啉、头孢地尼、头孢毗肟、头孢丙烯、头孢噻肟、头孢布烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、

亚胺培南、氯碳头孢和美洛培南敏感8.3选择性药敏结果报告NCCLS执行标准中对各种非苛养菌和苛养菌进行常规药敏试验和报告时，根据不同的要求分成A、B、C、U等不同的组。A组：用于常规和首选试验，其结果也应常规报告。B组：包含一些临床上重要、特别针对医院感染的药物，可用于首选试验，但只是选择性地报告临床，见附录6［技术说明（12）］OC组：包括替代性或补充性抗菌药物，见附录6［技术说明（13）］。U组：包含某些仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物（如呋喃妥因和某些喹诺酮类药物），对工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第10页共26页除泌尿道以外的感染部位分离的病原菌不应常规报告。其他具有较广治疗指征的药物也可包括于U组，主要针对一些特定的泌尿道致病菌（如铜绿假单胞菌）。为了提高试验报告与临床的相关性，减少滥用广谱抗菌药物造成的多重耐药菌株的流行，各单位应按本规范的要求和临床具体情况决定报告的抗菌药物药敏试验结果。8.4特殊情况下的药敏结果报告8.4.1克雷伯菌属、大肠埃希菌和奇异变型杆菌中的产ESBLs菌株应报告对所有青霉素类、头孢菌素及氨曲南耐药。8.4.2对于沙门菌属和志贺菌属的分离株只有氨苄西林、一种喹诺酮类药物和磺胺甲恶唑/甲氧苄啶可用于常规试验和报告，第一、第二代头孢菌素和氨基糖苷类抗生素体外可能对这些菌株有活性，但临床却无效，所以对上述药物不应报告为敏感。8.4.3沙门菌属的肠道外分离株应增加测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性。8.4.4肠球菌属对头孢菌素类、氨基糖苷类（仅筛选高水平耐药性X磺胺甲恶唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可能有活性，但在临床上耐药，所以不能报告对这些药物敏感。8.4.5对头孢西丁、苯唑西林耐药或证实有mecA基因或PBP2的葡萄球菌定义为耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS），应报告对所有青霉素类，头孢类和其它B-内酰胺类，如阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦和亚胺培南均耐药。8.4.6从威胁生命的感染（脑膜炎、菌血症、会厌炎和面部蜂窝组织炎）患者的血和脑脊液中分离的流感嗜血杆菌，常规只报告氨苄西林、一种第三代头孢菌素、美洛培南和氯霉素的药敏结果。8.4.7对分离于脑脊液中的细菌，下列抗菌药物不作为选择药物进行常规报告，因为用这些药物治疗某些细菌引起的感染可能是无效的，这些药物包括：仅通过口服途径给药的I和II代头孢菌素（除外头孢呋辛钠）、克林霉素、大环内酯类、四环素类、氟喹诺酮类。8.5药敏结果报告单的审核8.5.1审核药敏试验药物的选择和结果与菌株鉴定是否符合；8.5.2单个药物结果与在特定药物种类中活性规则层次是否一致（如，m代头孢对肠杆菌科菌活性高于I、I代头孢）；8.5.3分离菌对未被证明耐药的药物（规范中仅有“S”标准的药物）是否敏感。工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本:1.0页码：第11页共26页8.5.4非常见或不一致的结果应进行如下检查确认：1）誉写错误；2）试验污染（重新检查平板上菌株纯度等）；3）病人以前的结果（如病人以前分离的相同菌是否具有非常见的抗菌谱）。如果不能查明非常见或不一致结果的原因，必须重新进行药敏试验或菌株鉴定或按次序进行二者试验。

工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本:1.0页码：第12页共26页9.附录附录1非苛养菌常规药敏试验和报告中应考虑的抗菌药物的推荐分组（NCCLS）A组一级试验和常规报告的抗菌药物肠杆菌科细菌铜绿假单胞菌和其他非肠杆菌科细菌葡萄球菌属肠球菌属氨卞西林头孢他啶苯唑西林青霉素或氨苄西林头孢唑林头孢噻吩美洛西林或替卡西林哌拉西林青霉素庆大霉素庆大霉素B组一级试验选择报告的抗菌药物阿米卡星阿米卡星阿奇霉素或克拉霉素或红霉素万古霉素达托霉素利奈唑胺阿莫西林/克拉维酸或氨苄西林/舒巴坦哌拉西林/他唑巴坦替卡西林/克拉维酸头孢毗肟奎奴普丁/达福普丁头孢孟多或头孢尼西或头孢呋辛头孢哌酮氨曲南克林霉素头孢毗肟亚胺培南或美罗培南头孢美唑头孢哌酮头孢替坦头孢西丁替卡西林/克拉维酸万古霉素达托霉素泰利霉素安布霉素利奈唑烷头孢噻肟或头孢唑肟或头孢曲松甲氧苄啶/磺胺甲恶唑甲氧苄啶/磺胺甲恶唑环内沙星或左氧氟沙星环内沙星左氧氟沙星

工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第13页共26页厄他培南亚胺培南或美罗培南美洛西林或哌拉西林替卡西林甲氧苄啶/磺胺甲恶唑C组补充试验选择报告的抗菌药物氨曲南头孢他啶均为ESBLs指示药奈替米星环丙沙星或左氧氟沙星或氧氟沙星加替沙星或阿莫西林庆大霉素（只用于筛选高水平耐药株）链霉素（只用于筛选高水平耐药株）氯霉素氯霉素卡那霉素庆大霉素氯霉素红霉素利福平四环素（VRE菌株可以测这些药）奈替米星利福平四环素四环素安布霉素奎奴普丁/达福普丁U组补充试验用于泌尿道的抗菌药物羧苄西林洛美沙星或诺氟沙星或氧氟沙星洛美沙星或诺氟沙星环丙沙星左氧氟沙星诺氟沙星洛美沙星或诺氟沙星或氧氟沙星西诺沙星加替沙星氯碳头孢四环素磺胺异恶唑羧苄西林磺胺异恶唑甲氧苄啶/磺胺异恶唑甲氧苄啶呋喃妥因呋喃妥因呋喃妥因工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本:1.0页码：第14页共26页附录1（续）不动杆菌属、洋葱伯克霍尔德菌、嗜麦芽窄食单胞菌药敏试验分组不动杆菌属洋葱伯克霍尔德菌嗜麦芽窄食单胞菌A组一级试验并常规报告的药物头孢他啶甲氧苄啶/磺胺甲嗯唑甲氧苄啶/磺胺甲嗯唑亚胺培南美罗培南B组e一级试验有选择报告的药物阿米卡星庆大霉素妥布霉素头孢他啶左氧氟沙星氨苄西林/舒巴坦哌拉西林/他唑巴坦替卡西林/克拉维酸美罗培南米诺环素头孢毗肟米诺环素头孢噻肟头孢曲松环内沙星加替沙星左氧氟沙星多西环素米诺环素四环素美洛西林哌拉西林替卡西林甲氧苄啶/磺胺甲嗯唑工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本:1.0页码：第15页共26页附录2苛养菌常规药敏试验和报告中应考虑的抗菌药物的推荐分组（NCCLS）A组菌一级试验和常规报告的抗菌药物嗜血杆菌淋病奈瑟菌肺炎链球菌除肺炎链球菌外的其他链球菌氨卞西林红霉素红霉素青霉素（苯坐西林纸片）青霉素或氨卞西林甲氧苄啶蹒安甲恶坐甲氧苄啶/磺胺甲恶坐B组一级试验选择报告的抗菌药物头孢噻肟或头孢他啶或头孢坐肟或头孢曲松加替沙星司氟沙星莫西沙星左氧氟沙星氧氟沙星吉米沙星氯霉素头孢呋辛钠（针剂）万古霉素氯霉素四环素克林霉素美罗培南泰利霉素万古霉素C组补充试验选择报告的抗菌药头孢克洛或头孢丙烯或氯碳头孢头孢克肟或头孢噻肟或头孢泊肟或头孢坐肟或头孢曲松氯霉素头孢毗肟或头孢他啶或头孢曲松头孢地尼或头孢克肟或头孢泊肟头孢尼西利奈坐安利奈坐烷阿奇霉素或克拉霉素头孢美坐头孢替坦头孢西林头孢呋辛奎奴普丁/达福普丁氨曲南头孢呋辛酯（口服）

工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第16页共26页物环内沙星或加替沙星或左氧氟沙星或洛美沙星或氧氟沙星或莫西沙星或司帕沙星吉米沙星环丙沙星或加替沙星或氧氟沙星利福平左氧氟沙星氧氟沙星达托霉素厄他培南或亚胺培南青霉素利福平大观霉素四环素四环素泰利霉素

工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第17页共26页附录3非苛养菌稀释法和纸片法药敏试验的解释标准抗菌药物和细菌MIC(ug/ml)抑菌圈直径（皿）敏感耐药敏感中介耐药青霉素青霉素G葡萄球菌<0.1N0.25N29<28肠球菌W8N16N15<14苯唑西林金黄色和路邓葡萄球菌<2N4N1311-12<10其他凝固酶阴性葡萄球菌<0.25N0.5N18<17氨卞西林肠杆菌科<8N32N1714-16<13葡萄球菌<0.25N0.5N29<28肠球菌<8N16N17<16阿莫西林/克拉维酸葡萄球菌<4/2N8/4N20<19其他细菌<8/4N32/16N1814-17<13氨苄西林/舒巴坦<8/4N32/16N1512-14<11羧苄西林铜绿假单胞菌<128N512N1714-16<13纸片法：肠杆菌科和不动杆菌<16N64N2320-22<19稀释法：铜绿以外的其它革兰阴性杆菌美洛西林铜绿假单胞菌<64N128N16<15纸片法：肠杆菌科和不动杆菌<16N128N2118-20<17工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本:1.0页码：第18页共26页稀释法：铜绿以外的其它革兰阴性杆菌哌拉西林铜绿假单胞菌W64N128N18<17纸片法：肠杆菌科和不动杆菌W16N128N2118-20<17稀释法：铜绿以外的其它革兰阴性杆菌哌拉西林/他唑巴坦铜绿假单胞菌<64/4N128/4N18<17纸片法：肠杆菌科和不动杆菌<16/4N128/4N2118-20<17稀释法：铜绿以外的其它革兰阴性杆菌葡萄球菌<8/4N16/4N18<17替卡西林铜绿假单胞菌<64N128N15<14纸片法：肠杆菌科和不动杆菌<16N128N2015-19<14稀释法：铜绿以外的其它革兰阴性杆菌替卡西林/克拉维酸铜绿假单胞菌<64/2N128/2N15<14纸片法：肠杆菌科和不动杆菌<16/2N128/2N2015-19<14稀释法：铜绿以外的其它革兰阴性杆菌葡萄球菌<8/2N16/2N23<22阿洛西林铜绿假单胞菌<64N128N18<17头孢菌素

工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第19页共26页头孢孟多W8N32N1815-17<14头孢唑啉W8N32N1815-17<14头孢毗肟W8N32N1815-17<14头孢美唑W16N64N1613-15<12头孢尼西W8N32N1815-17<14头孢哌酮W16N64N2116-20<15头孢噻肟W8N64N2315-22<14头孢替坦W16N64N1613-15<12头孢西丁阴性杆菌W8N32N1815-17<14金黄色和路邓葡萄球菌W2N4N20<19其他凝固酶阴性葡萄球菌<0.25N0.5N25<24头孢他啶W8N32N1815-17<14洋葱伯克霍尔德N2118-20<17头孢唑肟<8N64N2015-19<14头孢曲松<8N64N2114-20<13头孢呋辛钠（注射）<8N32N1815-17<14头孢噻吩<8N32N1815-17<14拉氧头孢<8N64N2315-22<14头孢克洛<8N32N1815-17<14头孢克肟<1N4N1916-18<15头孢他美<4N16N1815-17<14头孢泊肟<2N8N2118-20<17头孢丙烯<8N32N1815-17<14头孢布烯<8N32N2118-20<17头孢呋辛酯（口服）<4N32N2315-22<14氯碳头孢<8N32N1815-17<14

工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本:1.0页码：第20页共26页单环内酰胺类氨曲南碳青霉烯类W8N32N2216-21<15亚胺培南W4N16N1614-15<13美罗培南W4N16N1614-15<13洋葱伯克霍尔德N2016-19<15厄他培兰W2N8N1916-18<15氨基糖昔类阿米卡星W16N32N1715-16<14卡那霉素W16N25N1814-17<1庆大霉素W4N8N1513-14<12肠球菌（高水平耐药）<500N500N107-9<6链霉素N1512-14<11奈替米星W12N32N1513-14<12安布霉素<4N8N1513-14<12糖肽类替考拉宁葡萄球菌<8N32N1411-13<10肠球菌<8N32N1411-13<10万古霉素葡萄球菌<2N16肠球菌<4N32N1715-16<14大环内酯类阿奇霉素<2N8N1814-17<13克拉霉素<2N8N1814-17<13地红霉素<2N8N1916-18<15红霉素<0.5N8N2314-22<13

工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第21页共26页喹诺酮类环内沙星W1N4N2116-20<15依诺沙星W2N8N1815-17<14氟罗沙星W2N8N1916-18<15左氧氟沙星葡萄球菌W1N4N1916-18<15其他细菌W2N8N1714-16<13洛美沙星W2N8N2219-21<18奈啶酸W16N32N1914-18<13诺氟沙星W4N16N1713-16<12氧氟沙星葡萄球菌W1N4N1813-15<14其他细菌W2N8N1613-15<12格帕沙星W1N4N1815-17<14加替沙星葡萄球菌<0.5N2N2320-22<19其他细菌W2N8N1815-17<14吉米沙星<0.25N1N2016-19<15罗美沙星<2N8N2219-21<18莫西沙星<0.5N2N2421-23<20司帕沙星<0.5N2N1916-18<15其他氯霉素<8N32N1813-17<12克林霉素<0.5N4N2115-20<14呋喃妥因<32N128N1715-16<14利福平<1N4N2017-19<16磺胺类<100N350N1713-16<12

工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第22页共26页甲氧苄啶W4N16N1611-15<10甲氧苄啶/磺胺甲恶唑<2/38N8/152N1611-15<10四环素W4N16N1915-18<14多西环素<4N16N1613-15<12米诺环素<4N16N1915-18<14磷霉素<64N256N1613-15<12奎奴普汀/达福普汀<1N4N1916-18<15利奈唑烷葡萄球菌<4N21肠球菌<2N8N2321-22<20达托霉素<4N11附录4纸片扩散法药敏试验流程图程序(TRP)按TRP艾置纸片Q围是不报告ST进入-QA.程序.no/药敏纸片/ •可靠的来源< •储藏2〜8o附录4纸片扩散法药敏试验流程图程序(TRP)按TRP艾置纸片Q围是不报告ST进入-QA.程序.no/药敏纸片/ •可靠的来源< •储藏2〜8oC或-14oC•开启后保持干燥•在效期之内应用按TRP报告分离菌株%CO2环境符锢『.标准从原始平板上挑取菌落接种判读结果用反射光透射光检测MRSA/VRE准备菌液的浊度标准管•制备BaSO0.5McFarlandstd.•储藏于室温暗处•每月检查，每6月更换 ..•-'制备MH琼脂•根据产品的要求•4mm厚度 、.•特定细菌加添加剂 '•每批号QC胸腺嘧啶\阳离子•每批:无菌试验&pH/•储藏在2o-PoC /.•在7d之内应用 ;孵育35oC，空气育血杆菌、淋球菌、链球药敏需根据NCCLSB准|解释抑菌环大小否是悬麒或生长法16-24h在室温平衡工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第23页共26页附录5纸片扩散法药敏试验检测特殊细菌的要点提示细菌琼脂接种方法孵育-35°C建议时间气体要求MRSAMHA直接菌悬液(DCS)24hrs空气Oxa纸片R&I结果需用另一方法重复试验肠球菌MHADCS或对数生长16-18hrsVan-24空气对HLAR+和治疗失败者筛选VRE和0-lac肺炎链球菌BMHADCS18-24hrs空气用Oxa纸片检测是否为PRSP，如耐药(<20)需测MIC嗜血杆菌HTMDCS16-18hrsC02p-lac试验可快速报告Amp-R淋病奈瑟菌GC添加DCS24hrsC02常规只需做p-lac试验脑膜炎奈瑟菌MHADCS18-24hrsC02常规不做药敏，仅在疾病预防时考虑工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第24页共26页附录6技术说明9.1A群和B群链球菌感染不需要常规做青霉素、其他B-内酰胺类及万古霉素的敏感试验。但是，当对青霉素过敏患者有链球菌感染时，就需检测链球菌对红霉素或其他大环内酯类的耐药性。9.2对一些耐药性容易改变的菌种应特别注意，如用第三代头孢菌素治疗肠杆菌属、柠檬酸杆菌属和沙雷菌属所致感染、用喹诺酮类治疗葡萄球菌属所致感染以及用各种抗生素治疗铜绿假单胞菌所致感染过程中都可能发生耐药。9.3商品化的药敏试验纸片通常分装于含有干燥剂的独立容器中，冷冻于-14'C以下冰箱中（避免反复冻融），B-内酰胺类抗生素的纸片应密封冷冻保存。但少量的日常工作用的纸片可冷藏保存于2C~8C至多一周。在使用前1〜2小时自冰箱中取出，在打开前平衡至室温，若使用商品化的纸片分装器，应配备一个紧密的盖子和足够的干燥剂，不用时冷藏保存，使用前平衡至室温。纸片必须在有效期内使用。9.4可直接购买MH琼脂平板或先购买脱水的培养基基础按照产品的说明自行制备：先将培养基经高压灭菌后水浴冷却至45C〜50C，倒入水平放置的无菌平皿中，厚度为4mm，冷却至室温。新制备的琼脂平板可当天使用或密封于塑料袋中，保存于2C〜8C。每批MH琼脂制备完成后都应抽样做无菌试验，并且应检测其pH值，凝固后的琼脂培养基在室温下的pH应为7.2〜7.4。使用前如培养基表面过分潮湿，应放于孵箱（35C）或在室温下敞开盖子倒置于层流罩中，直到多余的水分蒸发（通常10〜30分钟），在接种培养基时，其表面或平板盖子的表面不应有可见的潮湿水珠。9.50.5麦氏标准的BaSO4浊度标准管的制备方法如下:将0.5mL0.048mol/L的BaCl2（1.175%w/vBaCl2-2H2O）加入到99.5mL0.18mol/L的