小型猪近交群体的培育

小型猪近交群体的培育

wzsp来自海南岛中南部的山区。因其嘴长、体形尖小、行动灵活,素有“老鼠猪”之称。但因其生长慢、体小,曾经一度被认为是“低产品种”而不予保护,以致总饲养头数急剧下降。据报道20世纪60年代初海南岛尚存拦WZSP10万头,20世纪70年代初仅有600余头,1987年调查仅发现纯种猪10余头,已处于濒灭境地。1988年定点观测后,为保护这一濒灭品种,中国农业科学院畜牧研究所将仅存同窝的2头母猪(后死亡1头)、1头公猪引入北京。从此,开始了漫长的异地保种、繁育、种质测定、实验化近交培育、分子遗传学和开发利用研究。WZSP究竟有何保种价值?当时尚不易确切说清。因为过去对其种质特性的了解,仅限于体形外貌和一般生产性能,极不深入。对WZSP种质特性的多方位、深层次的研究结果发现:近交WZSPDNA指纹图、生长激素基因和受体基因、SLA基因分型等具有特异性;WZSP特有等位基因和MHSn基因频率为零的新发现,尤其是近交系的培育初步成功和在人类比较医学、生物技术开发应用方面展示出的诱人前景,较好的回答了WZSP作为实验动物方面应用的保种价值问题。开展的研究分述如下:1wzbs的实验研究1.1wzsp近交系谱的制备原WZSP是在特定的环境条件下,经历代近交繁育而形成基因高度纯合的稀有品种。由于种种原因70年代末导致濒灭,中国农业科学院畜牧研究所科技人员利用同窝1公1母,采用全同胞交配、父女交配和祖孙三世代内交配繁育,继续推进近交繁育,仔猪的成活率由F4的19.05%逐渐提高到F17的63.60%。到目前存栏F14种猪40余头,F15种猪38余头,F16种猪24头,F17种猪16头,已产出F18后代,并建立了WZSP近交系谱等。结果表明:WZSP近交繁育已跨越近交衰退及大批死亡的危险阶段。我国WZSP近交系的研究水平已领先国外至少10年,成为国内外专家共识的、世界的一流成果。1.2近交金分离对青年猪窝产仔数fps的影响通过500余头次数据分析结果表明:近交对WZSP繁殖力影响较大,F4仔猪成活率极低(19.05%,2/12),F10仔猪成活率较低(35.39%,6/27),但随着近交代数的增加,其仔猪成活率逐渐提高(F16,62.50%,10/16),其死胎、木乃伊比例逐渐降低(F4为8.33%,1/12;F17为0%,0/11),其窝产仔数亦有增加的趋势。但F13以后青年母猪第一次妊娠时间由原来的5～6月龄推迟到7～8月龄;初步发现随近交代数增加,其体重减轻趋势明显。据资料统计WZSP近交后代300余头未出现毛色分离现象(1996),表明经过F10近交后其毛色基因已达到高度纯合的程度。1.3wzsp近交系的建立以33.6为探针,对引种的两头种猪进行了DNA指纹图研究,其DNA指纹图相似系数为0.698,远远高于一般品种内个体间的常值(0.42～0.58),表明所引的两头种猪已为近交后代个体。研究结果还证实WZSPF8群体DNA指纹图相似系数(0.86)等同于西双版纳小型猪F12(0.86),WZSP世代DNA指纹图相似系数的轨迹符合近交小鼠的曲线图。这一结果将WZSP实验用近交系种猪实际的近交繁育向前推进了4个世代,并为WZSP近交系的建立,提供了坚实的理论基础和科学依据。利用不同染色体上的9个微卫星DNA标记,对WZSP近交系群体(未分家系前)遗传结构和遗传变异进行了研究,结果证实:所检测的微卫星基因座有1～3个等位基因,而通常普通猪一般有6～23个等位基因;9个微卫星基因座杂合度和多态信息含量在F14、F15、F16三个世代群体,分别为0.4201、0.4035、0.3259和0.3442、0.3353、0.3008,呈现递减趋势,即H14≥H15≥H16和PIC14≥PIC15≥PIC16。由此可见,随着近交世代的递增,群体的遗传变异降低。利用不同染色体上的9个微卫星DNA标记,对WZSP近交系三个家系群体遗传结构和遗传变异进行研究,证明:WZSP在9个微卫星位点的平均等位基因数2.11个,3个家系杂合度和多态信息含量分别为0.2934、0.2227和0.3005和0.2408、0.2075和0.1588;随着群体家系的建立,各家系间微卫星位点的平均等位基因数有所不同,但其杂合度和多态信息含量降低、基因纯合度提高。利用36个探针对WZSP近交系F13、F14进行遗传基因纯和度及同质化进行研究。结果每一个探针多数个体可得到1,2,3条图带、少数可得到6条图带,亦表明WZSP大部分位点基因已高度纯合。再次证实:WZSP近交繁育的可靠性、遗传的稳定性。2wzsp的gh基因在非编码区的变化依据WZSP生长曲线拟合公式和拟合度,可较准确的估测WZSP实验用近交系体重,使之向实验动物化推进了一大步。为各类动物模型培育、人源化猪器官移植开发应用研究提供了一定的科学依据。与正常猪种相比,WZSP的GH基因不仅在非编码区多处发生碱基替换或缺失,而且还在编码区发生了三个碱基替换并都导致编码的氨基酸残基改变,其中两个发生在高度保守区内,这可能影响到成熟GH基因的空间结构,进而影响其活性,成为五指山猪矮小的可能原因之一。此外,也证实GH受体基因与正常猪也有较大的差异。有关WZSP近交系猪GH基因和受体GH基因与其他品种猪相应基因的氨基酸序列相比较研究未见报导。综合分析,初步认为WZSP近交系属于侏儒动物一类,为今后WZSP实验动物化培育、探讨其矮小性机理等,奠定了科学依据。3wzsp分型多次测定结果证实:WZSP近交系50多项生理生化指标近似人类;近交繁育对其肝脏、肾脏等药物代谢、生化合成反应等与人类代谢未发现不匹配现象;依据人的血液分型方法,对WZSP实验用近交系F10、F16进行分型研究,显示WZSP血型均为O型(20/2次);WZSP肉质细嫩、香味浓,异地饲养仍能保持香味,而其他小型猪,如香猪异地饲养失去原产地香味浓的特色。研究发现WZSP肉质中的喹啉酸,丙二酸乙基戊基酯含量,分别显著高于市场肉8和20倍;WZSP肉质中含有丰富的各种氨基酸、含量高达72.615%,并含有三种人体必需氨基酸等。因此,WZSP不仅是理想的实验动物素材,又是提高肉猪肉质风味、用于杂交改良极佳的素材。4关于独特的遗产标记研究特有的遗传标记是作为实验动物必不可缺少的条件之一。WZSP具有独特的等位基因。5as-pcr检测wzsp中dqa的基因分型本研究完成了经典的SLAⅠ类及Ⅱ类基因(包括P1,P14,P7,DRA,DRB,DQA,DQB在WZSP群体SLAⅠ类及Ⅱ类分别为22头和60头)中的SNPs分析,并采用AS-PCR技术对存在多态的DQA,DRB和DQA、DQB基因进行分型等。5.1drb的测序分析DRA在WZSP群体中没有发现多态,DRB具有多态性,并对DRB进行了测序分析;DQB在WZSP实验用近交系群体中没有多态性,DQA具有多态性,并对DQA进行了测序分析。5.2slai的基因因素研究SLAⅠ类基因之间在多态结合区存在75%左右的同源性,而SLAI与HLAⅠ类基因多态结合区氨基酸序列存在50%～55%的同源性。5.3位点氨基酸序列同源性分析美国NIH小型猪已进行了系统的实验动物化培育和各种生理生化指标测定,是国际上公认的实验用小型猪,并应用于诸多人类多种疾病模型及生命科学实验研究。WZSP近交系与其对比结果表明:1)WZSP近交系猪种经典SLA-I类和II类基因及其氨基酸序列,与NIH小型猪相应基因进行同源性比较,发现DRA为高度保守序列,无多态性、核苷酸水平和氨基酸水平同源性均为100%;而对于其他具有多态性的基因,在核苷酸水平同源性也高达90%以上,在氨基酸水平同源性达87%以上。2)DQA、DRA相应基因的氨基酸序列与中国南方人群同源性达73%至83.7%左右;综上所述,SLA基因与NIH小型猪SLA和HLA基因分析比较,可以看出该品系SLA基因分型同NIH小型猪取得了近似的结果;与我国南方人群基因位点氨基酸序列具有77%～80%左右的同源性。WZSP近交系是人类理想的实验动物模型,并可与世界实验动物接轨;对其相关基因功能进一步分析、必要的修饰和改造后,作为中国南方人群异种移植物的提供者是可能的。6医用非织造材料的研究目前已同国内30多个科研院所进行了合作研究,先后将上千头猪用于药学、胚胎学、畜牧兽医学、比较医学和人类异种器官移植等诸多试验应用研究,如:1)动物异种器官移植比较医学研究(北京友谊医院、解放军309医院、佑安医院);2)人异种器官移植比较医学研究(四川大学医学院等);3)异种动物器官组织眼睫膜、胰腺细胞移植研究(同仁医院);4)国家一类新药毒性安检试验(中国医药开发中心、军事医学科学院、解放军301医院);5)心血管、血流图及冠状动脉硬化模拟试验(北京中医医科大学东直门附属医院);6)心血管疾病模型研究(北京友谊医院、阜外医院、中医医科大学东直门医院)7)烧伤、植皮移植试验研究(解放军304医院);8)人类去脂减肥技术动物模型试验(中国医科院外科整形医院);9)人类口腔疾病模型试验研究(北京口腔医科大学、天坛医院口腔研究所、武警总医院);10)猪胚胎干细胞和原始生殖细胞研究(北京大学、中科院上海细胞所-姚鑫院士课题组);11)SLA分型及免疫学研究(武汉同济医科大学、器官移植研究所等);12)猪瘟病毒、细菌等敏感性研究(中国兽药监察所等);13)WZSP肉质风味特性研究(北京微量研究所、中国农大食品学院)等。近期可明显看出的产业化前景是:为我国比较医学研究、异种器官移植等替代产品研究和应用提供合格的实验动物;培育SPF猪生物反应器,以适应人类输血等组织工程的需要;研制SPF人源化基因猪,解决我国人类器官移植供体(如心脏、肾脏等)不足的问题;用于肉猪杂交改良等。7wzsp与其他小型猪对比研究随着WZSP等品系小型猪的深入研究和广泛应用,已成为我国畜牧科学研究的新亮点之一。引起国际同行专家的关注,更引起国家科技部、农业部等政府部门的重视,将WZSP列为建立国家保种场项目、社会公益型项目、国家“十五”科技攻关等项目。目前,攻关协作组先后对300余头WZSP、贵州香猪和广西巴马等品系小型猪,分别检测了猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪流感病毒、戊型肝炎病毒、日本乙型脑炎病毒、衣原体、弓形体、布氏杆菌、萎缩性鼻炎、猪喘气病等13种病原的抗体,为随后开展剖腹净化工作、培育出符合国际标准的、具有我国特色的SPF化实验用小型猪奠定基础。总之,我国WZSP近交系等小型猪可创世界一流产品,可立竿见影地对国家的生物医学平台和农业生物技术平台提供支撑,抢占新的动物基因资源和相关产业的制高点。把握这个战略机遇将会实现巨大的经济价值。2.1年生农村小型猪生长预测模型的建立经过数百次测定和分析证实:WZSP具有体型小、性成熟早、6月龄体重15～20kg,24月龄体重35～40kg,较之国内外其他小型猪具有体重轻、个体小的优势。依据F12、F13、F14、F15和F16的初生重至6月龄、500头次体增重记录,进行指数曲线、logistic曲线、Compertz曲线分析,求出其三个曲线生长公式模式。拟合公式:W=4594.15e0.0063t;拟合度:0.77822.2zsp的检测方法矮小性和遗传稳定性是实验动物必须具备的两大要素,但WZSP近交系能否真正最终被确立为理想的实验用猪,关键在于是否具有矮小型基因特征?为此,从其生长激素水平入手,进而开展GH基因、受体基因序列等测定研究。结果发现:4.1wzsp近交系中微卫星座的分子分析通过2批、428头、9个品种猪的分子遗传学对比研究,发现WZSP近交系中微卫星