第16章 新方法、新技术

第十六章

药物分析中的新技术、新方法手性分离色谱一、手性药物的现状手性药物（579）药物（1992）天然和半合成药物（556）合成药物（1436）非手性药物（857）单一异构体（73）外消旋体（506）手性药物（547）非手性药物（9）单一异构体（537）外消旋体（10）二、手性药物对映体的药效学差异1.治疗作用完全依赖一种异构体如：S(-)-α-甲基多巴2.药理作用差别不大如：异丙嗪3.药理作用类似，但反应强度有差别4.药理与毒理作用存在“质”的区别二、手性药物对映体的药动学差异1.吸收2.蛋白结合3.代谢1.间接法拆分对映异构体即衍生化试剂法（CDR）2.直接法拆分对映异构体手性固定相法（CSP）手性流动相添加剂法（CMP）三、手性药物拆分的高效液相色谱法分类采用非手性固定相四、拆分原理：1.CDR(R)–SE+(R)–SA→(R)–SE–(R)–SA(S)–SA→(R)–SE–(S)–SA手性衍生化特点：需要高光学纯度的手性衍生化试剂；反应繁琐费时；衍生化反应速率重现性较差只需使用价格便宜、柱效较高的非手性柱衍生化过程可同时纯化样品柱前衍生化-反相高效液相色谱法拆分酮洛芬对映异构体S-(

)-酮洛芬R-(-)-酮洛芬酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图＊＊酮洛芬对映体的柱前衍生化方法酮洛芬对照品溶液(1mg/mL)0.1mL加入正己烷0.6mL二氯亚砜溶液0.2mL75℃1h冷却至室温吹干后加入S-NEA溶液0.2mL5min振摇加入2.0mol/LH2SO40.5mL混匀吹干后溶解进样二氯甲烷:乙醚2:1色谱条件色谱柱：HypersilC18,5

m,1505.0mmID，

流动相：乙腈水-乙酸-三乙胺(55:45:0.1:0.02，v/v)，流速：

1ml/min,检测波长：254nm酮洛芬对映体衍生化物色谱图RS酮洛芬对映体衍生化物的保留时间为tR=7.3min，tR=8.5min，分离度为1.92.CSP利用手性固定相与对映体消旋物相互作用，其中一个与手性固定相生成不稳定的短暂的对映体复合物，使两种异构体在色谱柱上的保留时间不同，从而得到分离。常用的手性固定相：1.Pirkle型相2.合成多聚相3.环糊精键合相特点适用范围广制备分离方便定量分析的可靠性高价格昂贵奈基乙脲键合硅胶柱拆分苏氨酸（A）和苯丙氨酸（B）的p-溴代苯甲酰胺衍生物对映体色谱图3.CMP将手性试剂添加到流动相中，利用手性试剂与药物消旋物中各对映体结合的稳定常数不同，以及药物与结合物在固定相上分配的差异，实现对映体的分离。常用的手性添加剂：1.配基交换型手性添加剂2.手性离子对络合剂3.环糊精添加剂特点可采用普通的非手性固定相不需对样品进行衍生化手性添加物的可变范围较宽高效毛细管电泳（HPCE）HPCE是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的一种快速、高效的液相分离技术。具有以下特点：1.高效2.高速3.微量4.低消耗高压电源毛细管恒温系统检测器数据处理系统毛细管缓冲液/样品缓冲液（+）(－)毛细管电泳装置示意图（一）基本原理：

v=veo+vep=(μeo+μep)E

veo：电渗流速度μeo：电渗流淌度

vep：电泳流速度μep：电泳流淌度E：电场强度－－－－－－－－－－－－－－－－－－++++++++++++++++++++++++++(－)(+)电渗的产生－－－－－－－－－－－－－－－－－－(－)(+)++++++++++++++++----------------毛细电泳中不同组分的迁移示意图（二）主要分离模式1.毛细管区带电泳（CZE）2.胶束动电毛细管色谱（MECC）3.毛细管凝胶电泳（CGE）4.毛细管等电聚焦（CIEF）

模式缓冲液体系分离机理CZE自由缓冲液离子淌度MECC胶束－缓冲溶液疏水性/离子性相互作用CGE凝胶－缓冲溶液分子大小和荷电数目CIEF两性电解质等电点1.毛细管区带电泳最基本、最广泛的分离模式。适用于所有具有不同淌度的荷电粒子的分离，但不能中性物质及质荷比相同的组分。

2.胶束动电毛细管色谱用离子胶束溶液代替简单的缓冲溶液，使中性组分可按其疏水性的不同及在两相间的分配系数的不同而分离。采用手性分配相，可用于手性化合物的分离。3.毛细管凝胶电泳凝胶的网络结构对溶质具有分子筛的作用，可分离质荷比相同但分子大小不同的组分。在分子生物学和蛋白质化学上有着十分广泛的应用。4.毛细管等电聚焦根据蛋白质的等电点不同而进行分离。AAAAAABBBBBBCCCCDDDDDEEEEEFFAAAABBBBCCCCDDDDEEEEFFFFpH梯度高低应用：1.监测药物生产过程如：监测青霉素发酵液中有关物质的量青霉素发酵液的高效毛细管电泳图1.青霉素G钠；2.6-APA；3.对羟基苯乙酸；4.邻羟基苯乙酸；5.苯乙酸2.中药成分分析如：黄酮及其甙类分析黄芩中6种黄酮类成分的胶束电动毛细管色谱分离图1.汉黄芩甙；2.黄芩素；3.黄芩甙；4.千层子素；5.汉