人牙周膜干细胞的分离纯化及生物学特性研究

人牙周膜干细胞的分离纯化及生物学特性研究

通常，牙周组织具有很强的修复能力，其修复活动通过从牙周膜上不同细胞的定向运动和分化来实现。疾病或在受到外界刺激时,通过牙周膜中未分化的间充质细胞的不断增殖和分化使组织再生。进一步研究发现,牙周组织发育完成后,存在于牙周膜中的这种未分化的间充质细胞具有自我更新和多向分化等成体干细胞的特点,能形成牙骨质-牙周膜样复合体,将其命名为牙周膜干细胞(PDLSCs)。本研究体外分离培养了牙周膜干细胞,并通过细胞超微结构观察、流式细胞周期分析及免疫组化染色等方法对其进行鉴定,旨在从不同角度对其有进一步的认识。1材料和方法1.1vmenin公司高糖型DMEM培养基;胎牛血清;胶原酶、胰蛋白酶、Dispase酶(Gibco公司,USA);ABC型免疫组化检测试剂盒(Dako公司,USA);鼠抗人波形丝蛋白单抗(Vimentin)(Dako公司,USA);鼠抗人骨粘素(anti-ON,BON-1)单克隆抗体、鼠抗人骨涎蛋白(anti-BSP)单克隆抗体(NIDCR,L.Fisher教授惠赠)、鼠抗人STRO-1单克隆抗体(SantaCruz公司);平底96孔板(Nunc公司,USA);倒置相差显微镜及照相系统(Olympus公司,Japan);流式细胞分析仪(Coulter公司,USA);70μm细胞筛网(Falcon公司,USA),JEM-20000EX透射电镜(JEC公司,Japan)。1.2细胞的分离和提取1.2.1细胞培养和传代收集临床上正常人拔除的牙周健康、无龋的新鲜第三磨牙,刮取根中1/3牙周膜组织,移入离心管内,加入3mg/ml的I型胶原和4mg/mlDispase轻轻震荡,37℃下消化1h,通过70μm筛网,获得单个离散的细胞,调整细胞密度为1×104/ml接种于5ml培养基(含200ml/L胎牛血清,100μmol/L-抗坏血酸,2mmol/L-谷胺酰胺,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素的DMEM培养基),37℃、50ml/L二氧化碳的孵箱中培养,3d后更换培养液弃去未贴壁的细胞,2~3d换液1次,收集对数生长期的牙周膜细胞的培养上清备用,细胞生长达80%汇合时传代。1.2.2适应性培养基将收集的对数生长期牙周膜细胞的培养上清按1500r/min离心10min,经0.22μm直径的小滤器过滤后,与培养基以1∶1比例混合作为适应性培养基。取对数生长期的第一代细胞用适应性培养基倍比稀释,调整细胞密度至10~15个/ml,吹打混匀,接种于96孔培养板中,100μl/孔,培养12h后标记单个细胞孔,并补液至200μl/孔,5d换液,待克隆长至孔底1/3~1/2后胰酶消化,扩大培养。1.3流式细胞术检测细胞周期将牙周膜干细胞扩大培养至约1×107/ml,胰酶消化,PBS洗后,加0.01mol/LPBS重悬细胞,吹匀后加入预冷的无水乙醇2ml吹打混匀,4℃过夜,离心弃乙醇,0.01mol/LPBS洗2遍,加入5ml/L的PI(碘化丙锭)1ml,4℃染色30min,过300目的尼龙筛网,流式细胞仪上机,进行细胞周期检测。1.4常规透射电镜检测细胞分离将牙周膜干细胞扩大培养至约1×107/ml,胰酶消化,0.01mol/LPBS洗1遍,收集于小离心管内,1500r/min离心10min,弃上清,25ml/L戊二醛液4℃固定细胞团块后,常规透射电镜标本固定、脱水、包埋、切片、染色、观察。1.5免疫组化染色取生长良好的克隆化培养的细胞制备细胞爬片,用免疫细胞化学ABC法染色进行Vimentin、STRO-1、ON、BSP免疫组化染色,阴性对照用PBS替代一抗,其余步骤不变,进行细胞来源及表达检测,光镜下观察。2结果2.1细胞生长和培养成功率酶消化法原代培养的人牙周膜细胞6h大部分细胞贴壁,24h开始伸展,72h大部分细胞伸展,约15~18d达到90%汇合。培养成功率低,本实验共取材22例,培养成功6例。细胞大多数长梭形,1~2个突起,少数为多角形、纺锤状或椭圆形,体积较小,胞体丰满(图1)。2.2胞克隆形成率采用适应性培养基,96孔板克隆化培养。10~15d有细胞克隆形成。此实验培养的细胞克隆形成率为0.62%。镜下观克隆状生长的细胞形态呈梭形,体积较小,细胞之间排列紧密,中心部细胞界限不清,呈圆形或不规则形状,周边部细胞呈梭形或多角形,部分细胞呈成纤维细胞状。继续培养30~35d长满孔底,胰酶消化传代扩大培养(图2)。2.3g0/3g期牙周膜干细胞细胞周期动力学结果显示:绝大多数细胞处于G0/G1期(94.4%),即静止期及DNA合成前期。G2期为5.6%,S期细胞为0。表明细胞增殖缓慢,绝大多数处于静止期或缓慢增殖期(图3)。2.4胞质和核质和核糖体透射电镜下,牙周膜干细胞呈圆形、椭圆形或不规则形,胞质少,核质比例大,部分胞质向胞核方向伸入指状突起,胞质内细胞器少,核糖体丰富,可见内质网和线粒体,胞核呈卵圆形,核仁大而明显(图4)。2.5ro-1染色胞质染色牙周膜干细胞抗Vimentin、抗STRO-1染色胞质着色,呈阳性表达,抗ON、BSP染色胞质着色,但较浅,阴性对照胞质均不着色(图5~8)。3细胞增殖动力学检测成体干细胞是指存在于成年机体组织器官中的特异性干细胞,在自然条件下,成体干细胞倾向于分化成所在组织的各种细胞,以利于维持机体的正常代谢,在特定的外界条件诱导下,一种组织的成体干细胞可以“横向分化”成为其它组织的功能细胞,参与组织修复重建。现已发现多种成体组织中都存在着干细胞,2000年Gronthos从人牙髓中获得了牙髓干细胞,那么,牙周膜中是否也存在干细胞2004年Byoung-Moo采用酶联合消化法将人第三磨牙牙周膜中分离培养的细胞与已经公认的骨髓基质干细胞、牙髓干细胞做了对比研究,发现采用酶联合消化法从牙周膜中分离的单细胞悬液与羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)粉混合植入免疫缺陷小鼠皮下,能形成牙骨质牙周膜样结构,并对其“横向分化”潜能做了研究,证明它具有多向分化的干细胞的特点,首次提出了牙周膜干细胞的概念。而有关人牙周膜干细胞研究目前国内尚未见报道。本实验按照Byoung-Moo的方法获得的细胞主要为胞体较大的成纤维样细胞和少量小而不规则形的细胞,提示分离的细胞可能由牙周膜细胞和不同分化阶段的细胞共同组成,具有异质性。因为牙周膜细胞是牙周组织中的主要细胞,干细胞的数量很少;另外干细胞具有不对称分裂的特点,除了产生与母细胞完全相同的子代细胞外,尚可产生在分化上更为成熟的子代细胞,故成体干细胞实质上是由处于不同分化层次的干细胞群组成。为进一步确定并分离纯化人牙周膜干细胞,我们采用有限稀释法进行克隆化培养,以从混合细胞中分离、纯化牙周膜干细胞。由于在体内,干细胞处于周围细胞及其因子形成的微环境中,而在体外如何保持其未分化状态是能否克隆化生长的关键。牙周膜成纤维细胞作为牙周膜中高分化的成牙骨质细胞的滋养细胞,它能产生多种细胞因子,可能抑制其中的未分化间充质细胞的分化。故为提高克隆形成率并尽可能的保持牙周膜干细胞的未分化状态,本组收集牙周膜细胞的培养上清制备成适应性培养基,结果成功地获得克隆化生长的牙周膜干细胞株。细胞周期是反映细胞增殖动力学的重要参考指标。干细胞多年来都被认为是慢周期性的,其周期慢于短暂增殖细胞,但增殖潜能大,常在组织再生时增殖速度提高。本实验细胞周期检测结果表明,克隆化培养的人牙周膜干细胞G0/G1DNA为94.4%,G2期为5.6%,S期细胞为0,与骨髓间充质干细胞、牙髓干细胞周期特点相似。这也从另一个侧面反映了本法分离得到的人牙周膜干细胞的干细胞特点。本实验对克隆分离的细胞通过透射电镜对其超微结构进行分析,发现克隆化生长的人牙周膜干细胞具有干细胞典型的超微结构表现:细胞圆形,体积小,核质比例大,核大,核仁明显,核糖体丰富,可见内质网,其它胞质细胞器少。这与其它成体干细胞超微结构表现一致,表明体外分离培养的牙周膜干细胞在一定条件下仍能保持其未分化状态。实验中我们对克隆分离培养细胞进一步进行免疫组化染色,结果显示:Vimentin染色阳性,显示其间充质来源,而STRO-1作为间充质干细胞表面相对特异性标志,也呈阳性染色,说明实验分离的细胞具有间充质源性干细胞的表型特点。ON(骨粘素)是表达于骨基质和牙齿形成阶段中的一种非胶原蛋白,在终末分化之前的成牙骨质、成牙本质、或成骨细胞中有表达,当细胞分化形成组织时,再次表达于形成的尚未矿化的组织中。本实验发现ON染色胞质着色,但较浅,提示该细胞具有矿化基质形成细胞的