苏云金芽孢杆菌转b基因植物的生物防治技术

苏云金芽孢杆菌转b基因植物的生物防治技术

太阳金芽孢（bt）是一种氧氧化阳性细菌。在形成发芽过程中，它也形成了一个有杀菌活性的随菌晶体，被称为杀死晶体蛋白（si）或-内毒素。昆虫通过提取晶体蛋白，通过肠道酶溶解，在65.70kvu下转化为具有n-3的有毒代谢物。它可以与昆虫中肠上皮细胞的特定结合点相结合，因为它的结构改变，进入细胞膜形成穿孔，导致细胞肿胀和分解，最终导致昆虫死亡。因此,可将Bt杀虫晶体蛋白基因克隆到大肠杆菌质粒中表达,或将其基因导入其他微生物,构建或改良可产生杀虫蛋白的工程菌来生产生物农药;也可将其转入植物体内,培育出各种抗虫作物,如在我国曾先后获得转Bt基因的烟草、甘蓝、棉花、玉米、水稻和油菜等作物,并成为世界上拥有自主知识产权、独立成功开发转Bt基因棉花的第2个国家。自1959年以来,作为生物杀虫剂,苏云金杆菌已经有50多年的开发应用历史,其主要用来控制鳞翅目、双翅目、鞘翅目害虫,近年来也报道了一些对膜翅目、直翅目、食毛目昆虫以及线虫、螨、原生动物有活性的Bt菌株。Bt作为生物杀虫剂具有以下优点:Bt杀虫晶体蛋白具有高度的专一性,只对靶标害虫有效,对天敌等其他昆虫无害;在环境中易降解,对人畜及环境安全。所以Bt被Ferré等称为“化学杀虫剂最有希望的取代者”,是目前世界上产量最大、应用最广泛的生物杀虫剂。据报道,由于Bt杀虫剂的使用,1996-2005年累计减少杀虫剂的使用量达22.43万t活性成分,相当于作物使用化学杀虫剂对环境的破坏作用降低了14%。因而,推广Bt植物和使用Bt杀虫剂,已成为当前保护生态环境、稳定生产及害虫综合防治的重要措施之一。然而,随着Bt使用量和转Bt基因作物的迅速增长,转入的Cry基因在作物体内持续表达,使害虫在整个生长周期都受到Bt杀虫蛋白的高压选择,因而害虫对Bt的抗药性已成为一个不容忽视的问题。自1985年McGaughey报道印度谷螟(Plodiainterpunctella)对Bt产生抗性以来,国内外已经发现室内至少有10种蛾类、2种甲虫、4种蝇类对Bt产生了抗性。其中小菜蛾(Plutellaxylostella)是惟一在田间对Bt产生抗性的昆虫。2003年Janmaat等、Kain等又发现,温室中的粉纹夜蛾(Trichoplusiani)对Bt存在抗性,这是继小菜蛾后又一个实验室外昆虫对Bt有抗性的报道,而且许多实验室已经获得了抗Bt作物的害虫品系。这些研究都表明,多种害虫具有对Bt产生抗性的潜在危险。因此,大面积使用Bt制剂和种植Bt作物,昆虫对Bt抗性的产生只是一个时间问题,研究昆虫对Bt的抗性机制,对于运用Bt制剂和Bt作物进行害虫综合治理以及延长转Bt基因作物的寿命显得极为重要。鉴于此,本研究从Bt的发现和分类及其结构与功能入手,在综述现有文献的基础上,详细介绍了Bt的杀虫机理及昆虫对Bt的抗性机制,阐述了昆虫体内Bt受体蛋白及其与抗性的关系,并对Bt作物害虫抗性治理策略和前景进行了展望。1bt毒蛋白基因的分类Bt能在芽孢内产生晶体蛋白——伴孢晶体(Parasoralcrystal)。1901年日本学者石渡首次从染病家蚕体中分离出苏云金杆菌,命名为“Bacillussotto”,并证明其对一些鳞翅目昆虫有杀虫活性。1911年Berliner从德国苏云金省的患病地中海螟(Ephestiakuehniella)中重新分离得到这种杆菌,并在1915年正式定名为“Bacillusthuringiensisn.sp.”,同时提出了利用病原微生物防治农业害虫的设想。Bt属原核生物细菌纲芽孢杆菌属,其分布十分广泛,可以从昆虫、土壤、水、植株中分离得到。早期的分类方法将Bt菌株依据营养细胞鞭毛抗原分为34个亚种,但这种命名法不能反映蛋白结构与专一杀虫活性的关系。1989年,Höfte和Whiteley根据已报道的42个Bt毒蛋白基因的氨基酸序列同源性和杀虫谱,提出了著名的H-W分类系统,将编码杀虫晶体蛋白的基因称为Cry基因,将Bt毒蛋白基因分为5个大类14个亚类,分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ命名,其中CryⅠ类对鳞翅目昆虫具有高毒性,CryⅡ类对鳞翅目和双翅目昆虫具有毒性,CryⅢ类对鞘翅目昆虫有高毒性,CryⅣ类对双翅目昆虫有毒性,CryⅤ类对鳞翅目和鞘翅目昆虫均有毒性。在每一类型下,用英文大写字母A、B、C等代表不同的基因型,然后用小写字母a、b、c等表示同一基因型由于核苷酸序列差异造成的基因亚型。另外还有仅对双翅目昆虫幼虫有毒性的Cyt型晶体蛋白。后来由于发现的Bt菌株逐步扩大,Bt毒蛋白的家族成员越来越丰富,使该分类系统表现出许多不足。1995年,杀虫晶体蛋白基因命名委员会对此提出了新的分类原则。新系统分类时只考虑杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性,而不再考虑杀虫谱的不同。按照蛋白质氨基酸序列的相似性,以45%,78%和95%为标准,将Cry基因分成4个等级。同源性小于45%为第1级,用阿拉伯数字表示,如Cry1、Cry2;同源性在45%~78%为第2级,用大写英文字母表示,如Cry1A、Cry2A;同源性在78%~95%为第3级,用小写英文字母表示,如Cry1Aa、Cry2Aa;同源性高于95%的为第4级,用阿拉伯数字表示,如CrylAa1、Cry2Aa2。这种方法也是目前对Bt进行分类和命名的主要依据,按照这种分类方法,到2003年全世界报道的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因序列己经超过250个。2结构组成及功能目前已克隆到大量的Bt晶体蛋白基因,并推导出了相应蛋白质氨基酸序列,但有关其空间结构的研究尚比较少,仅有Cry3Aa、Cry1Aa和Cry3Bb等少数几种晶体蛋白[23,26,27,28,29,30]。利用X射线衍射分析发现,这3种杀虫蛋白的三维结构非常相似,均由3个结构域组成:结构域Ⅰ位于肽链的N端,包括第1~290氨基酸残基,由6或7个α-螺旋围绕一个中央疏水的螺旋束,这一结构可能具有插入昆虫中肠道细胞膜形成孔道的功能;结构域Ⅱ位于毒蛋白活性片段中间,包括第291~500氨基酸残基,由3个具有相似拓朴(Topology)结构的β-折叠片(β-sheet)组成,这3个内面带有多个非极性氨基酸残基的β-折叠片结合在一起,形成了一个疏水性核心结构,其顶端的6个氨基酸残基参与受体的识别和结合过程;结构域Ⅲ位于晶体蛋白的C-端,包括第501~644氨基酸残基,由两组反平行的β-折叠片组成夹心结构,以β果酱卷(Jellyroll)拓扑结构排列,具有高度保守性,一般认为其具有维护蛋白质三维构象、保持蛋白质结构稳定、决定毒素的杀虫特异性以及保护蛋白质免受蛋白酶过度降解的作用,也可能与形成离子通道及与昆虫中肠上皮细胞结合有关。3bt毒素的作用机制伴孢晶体是Bt杀虫活性的主要来源,其可能由几种专一性很强的晶体蛋白即δ-内毒素组成。一般认为,δ-内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入及孔洞或离子通道形成等5个环节。对不同的昆虫有特异毒性的伴孢晶体,被昆虫取食后在昆虫中肠特殊的pH条件下被溶解并释放ICPs,在中肠蛋白酶的作用下毒素前体水解为有活性的毒素,有活性的毒素结合到中肠上皮细胞膜的特异性受体上,毒素亚基低聚形成孔洞结构并插入到顶膜上,这些孔洞允许离子和水分自由出入细胞,使细胞的通透性受到破坏,形成离子通道或孔洞,引起细胞膨胀和裂解,最后导致昆虫死亡。δ-内毒素的作用方式有以下几种:①δ-内毒素增加了K+的渗透性;②δ-内毒素诱导产生了阳离子选择性通道,使分别依赖于Na+和K+梯度的氨基酸吸收都受到抑制;③δ-内毒素引发形成了非选择性孔洞;④δ-内毒素直接抑制膜上的ATP酶,此种作用机制目前已被广泛接受。随着研究的不断深入,人们又提出了另外一种假设,认为毒性与毒素的低聚化无关。目前,对Bt毒素的作用机制形成了以下3种模型:(1)Bravo模型。该模型认为,钙粘蛋白(Cadherin-like)和氨肽酶N(AminopeptidaseN,APN)在烟草天蛾(Manducasexta)中对所有的Cry1A作用而言都是必需的,受体结合是连续进行的,活化的毒素首先与钙粘蛋白BT-R1结合,然后与APN结合。而毒素与BT-R1结合后,在膜结合蛋白酶的作用下其构象发生了变化,使α-螺旋更容易分离,这时毒素聚集起来形成一个四聚体的预穿孔结构,该结构优先与糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的受体碱性磷酸酶(ALP)和APN结合;GPI锚定受体直接引向抗去垢剂膜或脂筏,使穿膜过程更加容易;毒素穿膜后在顶膜导致膜电压、离子平衡的快速改变,水流入细胞,细胞膨胀,最终导致整个细胞裂解。(2)Zhang模型。Zhang等提出了新的Bt毒素作用模式,认为在毒素和细胞之间存在2种互作,第1种是毒素与磷脂之间的作用,毒素分子聚集成低聚体插入膜中,插入膜中的低聚体结构复杂,但并未形成孔洞,对细胞也没有毒素反应;第2种是毒素与钙粘蛋白受体BT-R1之间的特异性结合,从而激发了Mg2+依赖的信号路径的下游反应,引起细胞死亡,可见细胞死亡与Mg2+的信号传导路径关联。(3)Jurat-Fuentes模型。Jurat-Fuentes等对Cry毒素作用模式进行了修订,提出了一个更新的作用模式,认为可溶性的Cry1Ac晶体被活化为晶体单体而与钙粘蛋白HevCaLP结合,这种结合激活了磷酸酶调节的胞内信号路径。部分Cry1Ac毒素可以与肌动蛋白和胞内磷酸酶互作,大部分毒素与HevCaLP结合后,单体低聚化形成四聚体,结合在GPI锚定蛋白(APN、HvALP)上,这些锚定蛋白集中在脂筏上,毒素结合后将诱导脂筏的聚集。脂筏上毒素的浓度产生双重效果,诱导毒素插入膜内形成孔洞,同时激发胞内信号传导,信号传导一般受磷酸酶调控。激发细胞凋亡反应的胞内信号传导和渗透压诱导的毒素孔洞形成,同时致使细胞死亡。上述3种Bt毒素的作用机制模型针对的是鳞翅目昆虫,但防治蚊子的Bt菌株包含2种有协作效应的毒素,即Cry和Cyt,如Cyt1Aa能克服Cry毒素的抗性,所以双翅目昆虫Bt的作用模型与鳞翅目昆虫完全不同。Soberón等总结了蚊子中发现的Cry毒素受体和GPI锚定的ALP蛋白及Cyt1Aa,并阐明了这2种Bt毒素协作机制为Cyt1Aa,其可以作为Cry毒素与膜结合的功能性受体,具有抵抗Cry毒素的抗性。4抗性因素及其影响与使用化学农药一样,随着Bt制剂和转Bt基因作物的大面积推广和应用,害虫会在持续的选择压力下对Bt杀虫晶体蛋白产生抗性,且害虫抗性问题日益突出。有研究认为,害虫对Bt的抗性机制不是单一的。Heckle认为,Bt有10种潜在的抗性发展机制,主要与以下因素有关:①Bt毒素蛋白的溶解过程;②Bt毒素蛋白的水解性;③受体蛋白结合能力与结合位点的改变;④细胞膜上孔洞的形成;⑤中肠上皮的修复作用;⑥害虫在行为上对Bt毒素的逃避行为减少了毒素的摄入量等。其中毒素与细胞膜上受体结合能力的改变可能是产生抗性的主要机理。4.1晶体的释放出来原毒素被昆虫摄取后,首先必须在中肠里充分溶解,然后从晶体的点阵结构中释放出来进一步发挥毒性作用。如果溶解得不完全或者形成混合物,将影响毒蛋白的杀虫活性,最终导致昆虫抗性的产生。4.2抗性昆虫对bt各功能性状的影响原毒素溶解后必须在昆虫中肠的碱性环境及蛋白酶的作用下被水解和激活,然后释放出有杀虫活性的毒性肽,水解过度或未完全水解都会降低多肽的杀虫活性,其原因可能是毒素没有被昆虫体内的酶正确酶解,或者中肠蛋白酶的变化影响了杀虫蛋白的激活,因而产生的毒素片段不具备杀虫活性,从而导致抗性的产生。同时这种酶解一般并不是特异性的,因而害虫会产生高度的交互抗性。如印度谷螟(Plodiainterpunctella)抗性品系198r,Bt毒素在其中肠的水解活化低于敏感品系,这种差异主要是由于抗性品系中缺少一种主要的肠道类胰蛋白酶,这种酶的缺少导致Bt毒素在中肠中的毒性降低。Forcada等报道,烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)抗性品系的中肠蛋白酶对前毒素的加工明显减弱,但对活化的毒素分解加快,可能是抗性品系中肠蛋白酶组成成分发生变化引起的。徐艳聆研究表明,亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)抗性种群中强碱性类胰蛋白酶活性显著高于敏感种群,类胰蛋白酶基因序列TPL-2的核苷酸序列有27处碱基发生变化,其中7个碱基发生颠换,这些突变导致11个氨基酸的取代,推断这些变异与抗性的产生有关。梁革梅等发现,棉铃虫(Helicoverpaarmigera)抗性种群与敏感种群的总蛋白酶、弱碱性类胰蛋白酶和类凝乳蛋白酶活力差异不显著,但是抗性种群的乙酰胆碱酯酶活性升高,3龄幼虫的强碱性类胰蛋白酶活力也高于敏感幼虫,推测这种现象与抗性的产生有关。Candas等发现,抗性印度谷螟与敏感品系的双向电泳图谱存在差异,通过光谱分析和N-端氨基酸测定发现,抗性昆虫中肠上皮细胞中谷胱甘肽转移酶、细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ和NADH脱氢酶亚基5表达量的增长,导致了氧化还原反应的增加,胰凝乳蛋白酶含量的下降则使Bt杀虫蛋白在中肠中的活性降低,这些都可能是导致昆虫对Bt产生抗性的原因。Li等比较了抗性和敏感欧洲玉米螟蛋白酶的活力,结果发现敏感品系可溶性丝氨酸蛋白酶活力高于抗性品系,但膜结合的丝氨酸蛋白酶活力在这2个品系中并无差异,用抗性品系可溶性丝氨酸蛋白酶提取物处理Cry1Ab前毒素,发现毒素的水解减少了20%~30%。同时,也有关于Bt毒素蛋白在中肠的水解作用与Bt抗性没有关联的报道,如Heckel等认为,没有直接的证据证明烟芽夜蛾抗性品系CxC的抗性基因BtR-5和小菜蛾抗性品系NO-QA的抗性基因LG22,与中肠蛋白酶有任何关系,所以前毒素活化失败可能并不是其他昆虫品系中的一种主要抗性机制,毒素在中肠中水解过程的改变是否与抗性的产生有关,还需进一步研究。4.3抗性与中肠受体蛋白受体位于昆虫中肠上皮细胞的刷状缘膜囊泡(Brushbordermembranevesicles,BBMV)上,毒素蛋白与昆虫中肠特异受体位点结合能力的改变,被认为是昆虫对Bt产生抗性的主要原因,其中包括受体的改变、结合位点的减少和结合力的下降等。如室内筛选的对Cry1Ab抗性的印度谷螟抗性品系,其与Cry1Ab的结合力下降了50倍,该抗性品系对Cry1Ca敏感;相对于Cry1Ab而言,其与Cry1Ca具有不同结合位点,结合位点的改变导致了抗性品系对Cry1Ca敏感,结合位点亲和力的下降导致了其对Cry1Ab的抗性。研究发现,对Cry1Ab有抗性的田间小菜蛾的敏感性下降200倍以上,这可能是由于受体的缺失或是亲和性极度下降,导致抗性小菜蛾的受体蛋白不能与毒蛋白结合,而抗性品系对Cry1B和Cry1C的敏感性没有变化,这表明3种毒蛋白各有自己的受体,Cry1Ab的抗性变化并未影响别的受体而使其发生变化。Luo等研究认为,小菜蛾抗性品系和敏感品系的BBMV与Cry1Ac之间的结合能力并无差异,但抗性品系与毒素特异性结合受体的数目下降了3倍,推测小菜蛾对Cry1Ac产生抗性可能与结合位点数目的减少有关。Herrero等用碘标记毒素的方法研究了印度谷螟2种抗性品系(198r和DPI)的抗性机理,认为与敏感品系相比,DPI对Cry1Ab的结合位点浓度不变,但亲和力下降了60倍,198r的结合位点浓度和亲和力略有下降,但与活化毒素相比,198r对原毒素产生了11倍抗性,该抗性可能与中肠蛋白酶有关。Bt毒蛋白与受体蛋白的结合并不是抗性产生的直接原因,还有与受体相关钙粘蛋白介导的抗性。通过对烟草天蛾和家蚕(Bombyxmori)敏感品系钙粘蛋白结构域的研究发现,无论是在中肠膜上还是在表达的细胞系中,其都可以与Cry1A毒素结合。Jurat-Fuentes等在定位研究烟芽夜蛾抗性品系YHD2中与抗性相关的最主要基因BtR-4时发现,该基因在幼虫中肠中表达为钙粘蛋白;后续研究表明,该品系的钙粘蛋白基因被一段反向的转座子插入干扰,阻止了该基因的全长表达,并导致中肠膜上该蛋白的免疫检测性缺乏。在棉铃虫和红铃虫(Pectinophoragossypiella)中,钙粘蛋白的变化也与Cry1Ac的高抗密切相关。还有研究表明,其他受体如APN和ALP的表达量也与抗性相关。昆虫抗性与中肠受体蛋白作用的研究说明,昆虫的抗性与受体蛋白的变化直接相关,受体数目、结合位点和亲和性的改变等,均与抗性形成有关。但也有研究表明,结合位点数目和亲和性并不能完全解释抗性的形成,因此可能还存在其他的因子参与着昆虫的抗性作用。4.4膜上离子通道的交互抗性Bt毒素与受体蛋白结合后构象发生改变,插入到细胞膜上形成离子通道,如果这个过程受阻或者通道被堵塞都会造成抗性的产生,而且这种作用是非特异性的,因而易表现出交互抗性,被认为是最有效的一种抗性产生方式。4.5中肠上皮细胞损伤的机制Forcada等对烟芽夜蛾KCB抗性种群与敏感种群幼虫取食CrylAc的研究发现,两者的中肠上皮细胞损伤相似,推测可能是抗性幼虫中肠细胞有效的修复或替换,降低了其对Bt的敏感度,从而导致抗性的产生,这种机制会使害虫对Bt产生交互抗性。4.6抗过毒性反应昆虫取食含Bt的食物后,表现出快速的停食反应,或者迅速转移取食位置,从而减少毒素摄入量,或躲开最高Bt剂量,这也是抗性产生的方式之一。4.7围食膜与bt抗性的关系酯酶活力提高可以导致抗性的产生。Gunning等应用表面等离子体技术以及其他生物化学技术进行的体内研究表明,Bt抗性品系中的酯酶能结合Cry1Ac原毒素和活化毒素;体外试验表明,饲喂转Cry1Ac基因棉花或含Cry1Ac毒素的人工饲料时,棉铃虫酯酶活力较不进行处理的棉铃虫低,由此提出了酯酶螯合Cry1Ac的抗性机制。抗氧化能力增强可以引起抗性的产生。Candas等研究发现,抗性昆虫中肠谷胱苷肽利用的增加、氧化作用的增强以及不同的能量平衡维持,使许多特异性蛋白发生了变化;在抗性昆虫中,低分子质量的酸性蛋白F1F0-ATP酶增加,表明氨基酸的变化或某种蛋白质的改变,是昆虫产生抗性的重要因子;胰凝乳蛋白酶在抗性昆虫中肠中的减少,导致Cry毒素的活性降低,表明其是产生抗性的一种重要因素,这说明产生抗性的原因是多方面的,氧化代谢的增强是昆虫适应性的一种反应,并且为以后的抗性研究提供了一个很好的方法。围食膜防御功能的改变也可以引起抗性。Bt毒素蛋白在中肠消化液中溶解,其中的蛋白酶可以激活毒素蛋白,激活的蛋白只有穿过中肠围食膜才能达到中肠上皮细胞刷状缘膜上的作用位点,因此围食膜对Bt的杀虫活性和抗性机制也具有十分重要的作用。有研究证明,围食膜蛋白在昆虫杆状病毒增效蛋白的作用下被降解,破坏了围食膜结构的完整性,使昆虫失去了防御功能而增加了对Bt毒素蛋白的敏感性。也有报道指出,在对Cry1Ac具有抗性的家蚕品系中发现,Cry1Ac蛋白被滞留于围食膜中。以上研究均说明围食膜与Bt抗性相关。综上所述,昆虫对毒素的抗性机制是复杂多样的,目前对抗性机理尚无定论,已经提出的机制可能又被后续的研究结果所否定,但中肠结合位点的改变,一直以来都被认为是最主要的抗性机制。5bt抗性基因已有的研究表明,在昆虫体内主要存在氨肽酶N(AminopeptidaseN,APN)、钙粘蛋白(Cadherin-like)、碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,ALP)、肌动蛋白(Actin)和醣酯类(Glycolipid)等Bt受体蛋白,这些受体的变化与Bt抗性紧密相关。5.1apn与bt毒素的结合氨肽酶N是一组肽链端解酶,从蛋白质的N端水解中性氨基酸,昆虫中肠上皮细胞的糖基化磷脂酰肌醇C(Phosphatidylinositol-specificphosopholipaseC,PI-PLC),可将APN从膜上释放出来。根据氨基酸同源性,通常将APN分成氨肽酶N(N(EC31411112)、氨肽酶A(EC31411117)、氨肽酶P(EC31411119)和氨肽酶W(EC314111116)4大类。Knight等首先在烟草天蛾中发现了1种与Cry1Ac结合的蛋白,其分子质量为120ku,经鉴定是APN。随后多种昆虫的APN被分离和鉴定,且不同昆虫的APN数量可能并不一样。120ku的APN作为Cry1Ac的受体蛋白,现已在烟蚜夜蛾、舞毒蛾、小菜蛾、棉铃虫和家蚕中被发现和鉴定。另外,在棉铃虫中还发现了170,124和162ku的APN,在烟蚜夜蛾中发现了170和110ku的APN,在家蚕中还存在许多可以与Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac结合的APN异构体,这些异构体的分子质量分别为110,105,100,93和96ku,其中96kuAPN为APN3家族的1个新异构体。不同类型APN对不同毒素有不同的亲和性,不同昆虫的APN能与不同的Bt毒素结合,而且同一昆虫的不同APN与Bt毒素的结合特性也可能不同。研究表明,APN是鳞翅目昆虫中Cry1A等毒素的受体,其变异是导致昆虫对Bt产生抗性的主要原因。5.2btr175是抗br蛋白凝胶剂钙粘蛋白是另一种研究较多的鳞翅目昆虫Bt毒素受体蛋白,其主要以BT-R1和BtR175为代表。BT-R1是1种210ku的类钙粘蛋白,Francis等首先在烟草天蛾中发现BT-R1是Cry1Ab的受体,其他毒素如Cry1Aa和Cry1Ac也能与其结合。BtR175是175ku的类钙粘蛋白,是家蚕BBMV上Cry1Aa的受体蛋白,抗BtR的抗体能抑制毒素与膜泡结合,从而降低毒素对家蚕的毒力,当BtR175在细胞Sf9中表达并暴露在Cry1Aa中时,细胞的形态及膜电流发生了变化,表明BtR175的表达影响着Cry1A通过膜的渗透量,说明BtR175是Cry1Aa的1个受体。有研究表明,在烟草天蛾、家蚕和烟芽夜蛾中,钙粘蛋白是Cry1A毒素的靶标受体,钙粘蛋白基因的变异与昆虫对Bt抗性的产生密切相关,使得钙粘蛋白成为科学家们的又一个研究焦点,并且已有许多关于钙粘蛋白与抗性密切相关的报道。5.3抗高血压药物维持治疗2003年,McNall等应用蛋白组分析时,首次发现了烟草天蛾中Cry1Ac的2种新受体,即碱性磷酸酶(ALP)和肌动蛋白(Actin)。ALP与APN一样可被糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定,同时McNall等还建立了烟草天蛾BBMV中的Cry1Ac受体蛋白组以及与GPI锚定的受体蛋白组,并通过肽质指纹以及数据库搜索,确定65kuCry1Ac受体蛋白为ALP。2004年,Jurat-Fuentes等研究发现,烟蚜夜蛾抗性品系的ALP活性降低是烟蚜夜蛾对Cry1Ac产生抗性的原因。2006年,Fernandez等研究发现,GPI锚定的65kuALP为埃及伊蚊(Aedesaegypti)中肠上Cry11Aa的受体蛋白,该蛋白影响Cry11Aa的毒力,同时Cry11Aa又可以减弱ALP的活力。2007年,Jurat-Fuentes等发现,烟蚜夜蛾抗性品系的ALP表达量降低。5.4肌动蛋白与毒素的互作肌动蛋白(Actin)是2003年McNall等通过Western杂交结合肽质指纹的方法,在烟草天蛾中鉴定的与Cry1Ac结合的1种43ku蛋白。肌动蛋白是细胞骨架的组成成分,其作为Bt毒素的受体,尚一直存在疑问,但肌动蛋白排列在中肠细胞顶膜,当毒素渗透到中肠上皮细胞膜时就可以发生作用,肌动蛋白与毒素的互作将导致细胞骨架正常功能的破坏。2007年,Krishnamoorthy等利用蛋白组学结合Western杂交的方法,研究烟蚜夜蛾中Cry1Ac的受体,结果发现,V-ATP合成酶亚基A(V-ATPsynthasesubunitA)和肌动蛋白是烟蚜夜蛾中Cry1Ac的新结合蛋白,但要确定其是否为Cry1Ac的受体,还需要进一步验证。5.5bt抗性基因Griffits等最早发现,在模式生物线虫,即秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中,bre-5基因编码的β-1,3-半乳糖基转移酶与Bt毒素的抗性有关,bre-5基因的缺失会导致其对Cry5B产生抗性。Griffits等对4种与Bt抗性相关基因(bre-2、bre-3、bre-4、bre-5)的鉴定结果表明,bre基因编码4种糖基转移酶,参与醣酯的生物合成,在毒素向肠道运转过程中发挥作用;结合性试验表明,醣酯可与Bt毒素特异性结合,证明醣酯为Bt毒素的新受体,并且这种结合是糖依赖的,在体外与Bt抗性相关。在其他生物中也曾发现过类似的情况,但均未进行深入研究,例如,Kumaraswami等在小菜蛾的Cry1Ac抗性品系中发现,其醣酯类化合物的含量远低于敏感品系,虽然没有明确提到其可能是Bt毒素的功能受体,但推定其可能参与了抗性的形成。昆虫对Bt的抗性机制呈现出多样性,不同昆虫对不同Bt毒素的抗性机制不同,昆虫对Bt的抗性也是多种因素作用的结果,Bt毒素受体蛋白是研究Bt抗性的首要问题,随着人们对Bt抗性的关注,越来越多的与抗性相关的受体基因将被分离和克隆。因此,新受体的不断发现,将会揭示昆虫对Bt产生抗性的新机制,为害虫的抗性治理提供更加充足的理论依据。6bt作物抗病毒性研究由于害虫不可避免地对Bt毒素产生抗性,因此建立合理有效的害虫抗性治理策略(Insectresistancemanagement,IRM),对转Bt作物的可持续利用是至关重要的。Bt作物害虫抗性治理策略的建立经历了一个从传统(第1代)到现代(第2代)的过程。传统的害虫抗性治理策略主要是从理论上考虑的,这些策略的提出是建立在以往常规杀虫剂抗性产生的理论依据及工作经验的基础上,其途径主要有:(1)适度剂量(低剂量)的毒素表达确保敏感品系的生存比例。这个策略中Bt杀虫蛋白的表达量处于中等水平,允许一定比例的敏感昆虫存活。模型研究表明,该途径对抗性的延缓作用相对较小,而且低剂量的Bt表达量易受环境影响而不够稳定。1996年,澳大利亚第一批Bt棉商业化种植后,因达不到有害生物治理的期望效果而被弃用。(2)高剂量毒素表达杀死抗性杂合个体。从IRM角度看,该策略是一种比较有效的首选方法,因为抗性纯合个体出现很少,几乎可以忽略不计,抗性产生的速率主要取决于杂合体发生频率和生存率的影响,在高剂量表达的Bt作物上只有RR个体才能存活,而RS个体不能存活。因此,R基因在种群中被剔除,从而延缓了抗性的发展。(3)毒素的结合和叠加使用。即一种毒素失去控制作用后换用另一种,或在不同的空间同时使用不同的毒素。但模型和经验数据均表明,在不同空间使用不同毒素并不是最有效的延缓抗性的方法,但在一个品种中表达2种或更多毒素是目前延缓抗性的最好办法,但其前提条件是毒素间有不同的结合位点,以减少交互抗性。(4)特定时间特定部位表达毒素。通过使用非结构性的启动子,使毒素在害虫高峰和易受危害的部位表达,该方法早期被认为是最有潜力的方法,但害虫很容易在有毒素和无毒素的部位移动,从而失去了选择性表达的意义,反而加速了抗性的产生。(5)高剂量/庇护所策略。该策略首先要求Bt作物能高剂量地表达杀虫蛋白,以杀死所有敏感和杂合体害虫,并按比例在Bt作物周围种植非Bt植物,提供敏感个体与抗性个体进行交配,使其后代成为杂合体,达到稀释抗性基因的目的,从而延缓抗性的产生。该策略的提出是基于3个假设,即初始抗性基因频率很低(如<10-3)、隐性遗传及抗性和敏感昆虫自由交配。但研究表明,一些害虫并不符合其中的1个或更多的假设,如欧洲玉米螟、烟芽夜蛾、棉铃虫、美洲棉铃虫、小菜蛾等,就是不完全或非隐性遗传的。另外,该策略还有一系列应用上的局限性。如Chilcutt等研究显示,在Bt植株种子发育阶段,花粉可能会漂移到非植株上,从而使害虫处于低选择压下,同时种植高毒的、无毒的和有毒的植株,不可避免地会造成污染,模型显示即便是很低频率的无毒种子混在Bt种子中,也将很明显地加速抗性的发展。其次,高剂量庇护所使害虫对Bt的敏感性不一致,该策略是基于杂合子高死亡率的假设,而害虫对Bt的敏感性不同,同一毒素对一个种群而言是高剂量的,但对另一个种群而言则可能是中等程度或者不敏感的,因此高剂量策略不可能对所有的害虫达到一个统一的剂量。尽管高剂量/庇护所策略存在不足之处,但大多数专家仍然认为这是目前可利用的最有效的抗性延缓策略。目前,抗性治理策略需要进一步地改善并使其更具实用性,而新技术的不断发展使Bt作物的抗性治理又进入了一个新阶段。值得欣慰的是,获得的新形式转基因菌株可与现存的杀虫蛋白混合或者匹配,以及非传统的杀虫蛋白正在被发现和研制,由此产生了以下几种现代(第