败酱草抗呼吸道合胞病毒作用的初步观察

败酱草抗呼吸道合胞病毒作用的初步观察

呼吸道感染（gsv）是世界上影响婴儿呼吸感染的重要病原体。目前开发研制出有效防治呼吸道合胞病毒感染的新药已成为各国学者研究的热点。败酱草(HerbaPatrinea)是中国传统中药,为了解败酱草抗呼吸道合胞病毒作用,本实验用细胞培养法对其抗呼吸道合胞病毒作用进行检测。1材料和方法1.1制备水提液制备水提液败酱草全草1000g用清水洗5~6遍,用蒸馏水清洗2~3遍,蒸馏水7000ml浸泡12h,于100℃煮沸90min后用脱脂棉过滤,药渣加5000ml蒸馏水煮沸90min后用脱脂棉过滤,将2次滤液混合,于100℃蒸发浓缩至1.0g/ml,制成水提液,经3日间歇灭菌法灭菌。阳性对照药物为病毒唑(Ribavirin)粉剂,由黑龙江省药物检测所提供,用蒸馏水制成含量为1.0mg/ml的溶液。1.2常规的传代培养人宫颈癌传代细胞HeLa,由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。常规方法传代培养。细胞生长液为含5%小牛血清,1%青、链、庆大霉素的MEM溶液;细胞维持液为含2%小牛血清,1%青、链、庆大霉素的MEM溶液。1.3中国预防医学院病毒学研究组呼吸道合胞病毒(RSV)Long株,由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。在HeLa细胞中的组织半数感染量(TCID50)为10-7.7。1.4细胞形态观察用细胞维持液将药液连续0.8倍稀释,按常量分别加入细胞已长成单层的96孔培养板中,置37℃、5%CO2温箱培养,每日倒置显微镜下观察细胞形态,连续观察3d。每个剂量加入4孔细胞,同时设立4孔正常细胞作为细胞对照。计算药物半数中毒浓度(TC50)。1.5细胞形态观察和药物对照采用细胞病变抑制实验(CPEI)对药物进行药效学检测。已长成单层的细胞接种剂量为50TCID50的病毒后置于37℃、5%CO2温箱孵育2h。弃去含病毒维持液,更换含不同浓度药物的维持液,置于37℃、5%CO温箱内培养。每天观察细胞形态,连续观察3d,记录细胞病变(CPE)程度。CPE程度:“0”表示无CPE,“1”表示CPE为1%~25%,“2”表示CPE为25%~50%,“3”表示CPE为50%~75%,“4”表示CPE为75%~100%。同时设立正常细胞对照、病毒对照和阳性药物对照各4孔。计算药物半数有效剂量(EC50)和治疗指数(TI)。1.6置石与测定条件已长成单层的细胞中接种剂量为50TCID50的病毒后置4℃,60min。弃去病毒液,更换正常维持液,于0,2,4,6和8h分别加入同浓度药液,置于37℃、5%CO2温箱孵育,培养观察,记录CPE程度。1.7量效反应tc50Reed-Muench法计算药物半数中毒浓度(TC50)和半数有效浓度(EC50)、治疗指数(TI)=半数中毒浓度(TC50)/半数有效浓度(EC50);Kruskal-Wallis检验法比较药物各剂量组与病毒对照组细胞病变程度的总体分布及不同给药时间各组药物与病毒对照组细胞病变程度的总体分布;对药物各剂量对数和CPE抑制率进行回归分析,判定是否存在量效反应关系。采用SAS软件完成数据处理。2结果2.1药物毒性试验根据所得数据,采用Reed-Muench法计算败酱草TC50为32mg/ml。病毒唑TC0大于500μg/ml。2.2组reed-uench法计算Kruskal-Wallis检验法比较药物各剂量组与病毒对照组细胞病变程度。结果表明,败酱草水提液的5,2.5,1.25,0.625mg/ml剂量组,Ribavirin10,5,2.5μg/ml剂量组,对RSV均有明显抑制作用(P<0.01)。采用Reed-Muench法计算,败酱草水提液的EC50为0.54mg/ml,TI为59.26。病毒唑EC50为1.43μg/ml,TI大于349(表1)。2.3败酱草水提液抑制rsv致细胞病变的作用以药物计量的对数为横坐标,以抑制率为纵坐标绘图,可见败酱草水提液抑制RSV致细胞病变的作用都随着药物剂量的增加而增强;对药物剂量对数和CPE抑制率进行相关分析,均呈现出明显的正相关关系。2.4加药抑制活性结果表明,败酱草组于呼吸道合胞病毒感染后0,2,4h加药,有抑制活性(P<0.01);Ribavirin组于呼吸道合胞病毒感染后0,2,4h加药,有抑制活性(P<0.01)(表2)。3败酱草对呼吸道合胞病毒的抑制作用本实验运用细胞培养技术,对败酱草抗呼吸道合胞病毒作用进行体外研究。败酱草在HeLa细胞中半数中毒浓度为32mg/ml,在HeLa细胞中抗呼吸道合胞病毒的半数有效浓度为0.54mg/ml,治疗指数TI为59.26。败酱草对呼吸道合胞病毒抑制作用存在明显的量效关系。在不同时间加药实验中,由于在4℃培养1h时病毒只吸附于细胞表面,并不会穿入细胞膜。在37℃时病毒穿入细胞膜,进行复制。不同时间加药实验