第十章 免疫系统及其功能的分析技术

第十章

免疫系统及其功能的分析技术免疫系统及其功能的分析技术第一节

免疫细胞的分离与保存第二节

免疫细胞及其功能测定第三节

免疫分子测定第四节机体免疫功能的研究和测定免疫系统及其功能的分析技术第一节

免疫细胞的分离与保存第二节

免疫细胞及其功能测定第三节

免疫分子测定第四节机体免疫功能的研究和测定第一节免疫细胞的分离与保存一、免疫细胞分离的原理与技术二、各类免疫细胞的分离第一节免疫细胞的分离与保存一、免疫细胞分离的原理与技术二、各类免疫细胞的分离1.细胞密度差异2.细胞粘附及吞噬差异表面标志分子对低渗的敏感性特异性促生长因子正选分离与负选分离一、免疫细胞分离的原理与技术1.细胞密度差异2.细胞粘附及吞噬差异表面标志分子对低渗的敏感性特异性促生长因子正选分离与负选分离一、免疫细胞分离的原理与技术1.细胞密度差异人外周血细胞的密度为：红细胞1.093，粒细胞1.092，单个核细胞1.075～1.090，血小板1.030～1.035。1.细胞密度差异2.细胞粘附及吞噬差异表面标志分子对低渗的敏感性特异性促生长因子正选分离与负选分离一、免疫细胞分离的原理与技术细胞粘附差异分离方法

利用单核/巨噬细胞较强的粘附能力，从单个核细胞悬液中去除或者收集单核/巨噬细胞。粘附贴壁法：细胞粘附差异分离方法吸附柱过滤法利用单核/巨噬细胞所具有的吞噬能力，采用磁场、沉淀、荧光等方法对细胞进行分离。玻璃纤维或葡聚糖凝胶吸附，收集未吸附的淋巴细胞尼龙纤维吸附B细胞，游离细胞为T细胞细胞吞噬能力差异分离技术加入直径为3um的羰基铁颗粒或乳胶颗粒，待单核/巨噬细胞充分吞噬颗粒后，再用磁场吸附或通过密度梯度离心，获得较纯的淋巴细胞。1.细胞密度差异2.细胞粘附及吞噬差异表面标志分子对低渗的敏感性特异性促生长因子正选分离与负选分离一、免疫细胞分离的原理与技术3.表面标志分子（1）E-玫瑰花环沉降法（2）亲和淘洗法（3）补体介导的特异性细胞毒分离法（4）荧光激活细胞分离法（5）免疫磁珠分离法（1）E-玫瑰花环沉降法（Erosettesedimentation）（2）亲和淘洗法（Biopanning）在补体的作用下裂解与抗体结合的细胞，从而分离出不能与此抗体结合的细胞亚群。这是一种负选性分离法，简称细胞毒法。（3）补体介导的特异性细胞毒分离法（4）荧光激活细胞分离法方法快速、特异、高效，分离效果可与FACS法媲美，对仪器的要求却低得多。（5）免疫磁珠分离法（immunomagneticmicrobeads）1.细胞密度差异2.细胞粘附及吞噬差异表面标志分子对低渗的敏感性特异性促生长因子正选分离与负选分离一、免疫细胞分离的原理与技术4.对低渗的敏感性红细胞对低渗的敏感性要高于白细胞，故可用不损伤白细胞的温和低渗液处理以除去红细胞。

低渗裂解法：蒸馏水

氯化铵处理法：0.83%氯化铵1.细胞密度差异2.细胞粘附及吞噬差异表面标志分子对低渗的敏感性特异性促生长因子正选分离与负选分离一、免疫细胞分离的原理与技术5.特异性促生长因子利用免疫细胞生长对细胞因子的特殊需求，对免疫细胞进行有针对性地培养。如：IL-2联合特异性抗原刺激可制备特异性T细胞克隆；IL-4加上GM-CSF可以诱导PBMC中DC细胞前体的生长和分化为成熟DC。1.细胞密度差异2.细胞粘附及吞噬差异表面标志分子对低渗的敏感性特异性促生长因子正选分离与负选分离一、免疫细胞分离的原理与技术6.正选分离与负选分离正选分离（positivesorting）：利用细胞的特性将所要的细胞选择性分离出来，其余的细胞丢弃不用。负性分离（negativesorting）：利用细胞的特性将不要的细胞选择性分离除去，余下的细胞就是所要的细胞。第一节免疫细胞的分离与保存一、免疫细胞分离的原理与技术二、各类免疫细胞的分离二、各类免疫细胞的分离1.白细胞的分离自然沉降分离后，将红细胞裂解2.单个核细胞和淋巴细胞的分离聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心吸附法去除巨噬细胞3.T、B淋巴细胞的分离E花环沉降法尼龙毛柱分离法

4.NK细胞和LAK前体细胞的分离

Percoll密度梯度离心法分离

单核细胞去除法:粘附法

B淋巴细胞去除法:尼仑棉纤维

T淋巴细胞去除法:E-玫瑰花环沉降法5.单核/巨噬细胞的分离

Percoll密度梯度离心

粘附法纯化单核/巨噬细胞二、各类免疫细胞的分离二、各类免疫细胞的分离6.树突状细胞的分离密度梯度离心法粘附法表面标志7.淋巴细胞亚群的分离免疫磁珠法FACS法亲和板淘洗法细胞毒法分离免疫系统及其功能的分析技术第一节

免疫细胞的分离与保存第二节

免疫细胞及其功能测定第三节

免疫分子测定第四节机体免疫功能的研究和测定第二节免疫细胞及其功能测定一、免疫细胞表面标志和亚群测定二、淋巴细胞增殖试验三、细胞介导的细胞毒试验四、活性分子分泌功能的测定五、吞噬细胞功能测定六、抗原递呈功能检测第二节免疫细胞及其功能测定一、免疫细胞表面标志和亚群测定二、淋巴细胞增殖试验三、细胞介导的细胞毒试验四、活性分子分泌功能的测定五、吞噬细胞功能测定六、抗原递呈功能检测一、免疫细胞表面标志和亚群测定免疫荧光法酶免疫染色法花环形成试验补体依赖的微量细胞毒试验细胞粘附法MHC-肽四聚体技术1.免疫荧光法4.补体依赖的微量细胞毒试验6.

MHC-肽四聚体技术第二节免疫细胞及其功能测定一、免疫细胞表面标志和亚群测定二、淋巴细胞增殖试验三、细胞介导的细胞毒试验四、活性分子分泌功能的测定五、吞噬细胞功能测定六、抗原递呈功能检测二、淋巴细胞增殖试验3H-TdR掺入法MTT法形态学计数法1.3H-TdR掺入法（3H-TdRincorporationassay）第二节免疫细胞及其功能测定一、免疫细胞表面标志和亚群测定二、淋巴细胞增殖试验三、细胞介导的细胞毒试验四、活性分子分泌功能的测定五、吞噬细胞功能测定六、抗原递呈功能检测三、细胞介导的细胞毒试验形态学观察法细胞内容物释放法

51Cr释放法

乳酸脱氢酶释放法凋亡细胞检测法

形态学观察DNA凝胶电泳TUNELAnnexinV/PI线粒体跨膜电位检测51Cr释放法（51Crreleaseassay）AnnexinV/PI第二节免疫细胞及其功能测定一、免疫细胞表面标志和亚群测定二、淋巴细胞增殖试验三、细胞介导的细胞毒试验四、活性分子分泌功能的测定五、吞噬细胞功能测定六、抗原递呈功能检测四、活性分子分泌功能的测定酶联免疫斑点法溶